實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）實(shí)驗(yàn)流程

    一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉(zhuǎn)錄)
　　
　　不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因?yàn)镽eal-TimePCR對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實(shí)驗(yàn)前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
　　
　　在總rna的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂;取2ug進(jìn)行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時(shí)，要用DNaseI進(jìn)行消化(因?yàn)樵谔幚磉^程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑)。
　　
　　二、DNAseI消化樣品RNA中的DNA
　　
　　用DNaseI消化DNA
　　
　　組份加量
　　
　　模板(RNA)10ug
　　
　　RNaseInhibitor4ul
　　
　　DNaseIbuffer10ul
　　
　　DNaseI10ul
　　
　　DEPC處理H2O至100ul
　　
　　混勻，37℃90min
　　
　　三、RNA瓊脂糖凝膠電泳
　　
　　1.1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：
　　
　　1)稱取瓊脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS緩沖液和39.5ml的DEPC水，放微波爐里溶化。
　　
　　2)待冷卻到60攝氏度左右時(shí)，加入1ml甲醛，搖勻(避免產(chǎn)生氣泡)。倒入凝膠板上凝固30min。
　　
　　2.取各個(gè)RNA樣品4µl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2µl混勻，加入變性膠加樣孔中。
　　
　　3.120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。
　　
　　4.RNA電泳結(jié)果如下圖所示�？梢�28S和18S兩條明亮條帶，無DNA條帶污染。
　　
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）實(shí)驗(yàn)流程
　　
　　四.RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA
　　
　　反轉(zhuǎn)錄程序(以MBI的M-MLV為例)
　　
　　組份加量(20ul體系)加量(40ul體系)
　　
　　模板(RNA)0.1~2.5ug(根據(jù)條帶的亮度適當(dāng)調(diào)整)3ug(根據(jù)條帶的亮度適當(dāng)調(diào)整)
　　
　　引物T18(50uM)(或其他引物)2.0ul4.0ul
　　
　　DEPC處理H2O至12.5ul至25ul
　　
　　混勻，70℃5min，立即冰浴
　　
　　5*buffer4.0ul8.0ul
　　
　　dNTP(10mM)2.0ul4.0ul
　　
　　RNaseInhibitor0.5ul1.0ul
　　
　　混勻，37℃5min
　　
　　M-MLV1.0ul2.0ul
　　
　　42℃60min，70℃10min
　　
　　反轉(zhuǎn)錄引物的選擇與Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)的要求
　　
　　1)隨機(jī)六聚體引物：
　　
　　當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以拷貝其全長序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA*鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。
　　
　　2)Oligo(dT)：
　　
　　是一種僅對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。特別適合檢測多個(gè)基因的表達(dá)，這樣可以節(jié)約反轉(zhuǎn)錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測稀有基因是否表達(dá)、從極少量細(xì)胞中定量檢測特定mRNA的表達(dá)水平。
　　
　　3)特異性引物：
　　
　　zui特異的反轉(zhuǎn)錄方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，*條鏈的合成可由與mRNA3’端zui靠近的配對(duì)引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。
　　
　　做RealTimePCR時(shí)，用于SYBRGreenI/EvaGreen法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物，在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求：
　　
　　①Tm=55-65℃
　　
　�、贕C=30-80%
　　
　　③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300bp之間都可。
　　
　�、芤�物的退火溫度要高，一般要在60℃以上。
　　
　　要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，zui好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
　　
　　至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都應(yīng)該可以的。做染料法zui關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不易。
　　
　　五、cDNA與引物質(zhì)量檢測
　　
　　取0.2ml薄壁PCR管，編號(hào)。向各管中加入含染料2×PCRTaqMix10ul;加入正反向引物各0.5ul(引物濃度10uM)，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管補(bǔ)加水至20ul。
　　
　　組份加量
　　
　　2×PCRTaqMix10ul
　　
　　10uMPrimerFW0.5ul
　　
　　10uMPrimerRV0.5ul
　　
　　TemplateDNA1ul
　　
　　ddH2O混勻至20ul
　　
　　混勻，置于TP600PCR儀中。95℃5min;95℃15s，60℃35s，40cycles;72℃5min;4℃pause。
　　
　　取擴(kuò)增產(chǎn)物各8μl，DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)5μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察。
　　
　　選擇特異性好，擴(kuò)增效率高的引物作為實(shí)時(shí)熒光使用引物。
　　
　　六、利用相對(duì)定量的方法分析目的基因表達(dá)量的情況：
　　
　　由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些看家基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達(dá)調(diào)控分析時(shí)至少要做兩個(gè)基因，目的基因和一個(gè)看家基因。
　　
　　七、定量PCR檢測：
　　
　　取0.2ml薄壁PCR管，分別編號(hào)。向各管中加入2×qPCRTaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，對(duì)應(yīng)的cDNA各1ul。一管中不加模板用作陰性對(duì)照。各管補(bǔ)加水至25ul。
　　
　　組份加量
　　
　　模板(cDNA)/ddH2O1.0ul
　　
　　10uM引物F/R0.5ul
　　
　　2×qPCRMix12.5ul
　　
　　ddH2O11.0ul
　　
　　混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預(yù)變性后，95℃15s→65℃35s(熒光檢測)，40cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴(kuò)增設(shè)成一個(gè)溫度，只在擴(kuò)增出現(xiàn)問題時(shí)才會(huì)考慮設(shè)梯度。
　　
　　八、擴(kuò)增曲線和溶解曲線
　　
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）實(shí)驗(yàn)流程
　　
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）實(shí)驗(yàn)流程
　　
　　溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴(kuò)增。
　　
　　一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期，其形狀是一條平滑的S型曲線。
　　
　　如果在熒光背景信號(hào)階段出現(xiàn)很多拐點(diǎn)，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì);
　　
　　如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。
　　
　　如果引物二聚體存在則陰性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在Real-TimePCR中很難避免;
　　
　　若是陰性對(duì)照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用。
　　
　　在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能：
　　
　　①引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個(gè)，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設(shè)計(jì)引物;
　　
　�、谠谧龌�因表達(dá)差異時(shí)容易出現(xiàn)DNA被擴(kuò)增峰(只在引物跨內(nèi)含子時(shí)存在)，出現(xiàn)原因是提取RNA時(shí)存在DNA污染，可以通過電泳驗(yàn)證，這時(shí)要重新消化RNA樣品中的DNA;
　　
　�、蹟U(kuò)增非特異，這時(shí)要重新摸擴(kuò)增條件或重新設(shè)計(jì)并驗(yàn)證引物。
　　
　　九、表達(dá)差異的計(jì)算方法
　　
　　絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù);相對(duì)定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異之間的表達(dá)差異。
　　
　　2-△△CT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡便方法。
　　
　　在有些情況下，并不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對(duì)定量，只需要給出相對(duì)基因表達(dá)差異即可。顯然，我們說X基因在經(jīng)過某種處理后表達(dá)量增加2.5倍比說該基因的表達(dá)從1000拷貝/細(xì)胞增加到2500拷貝/細(xì)胞更加直觀。
　　
　　2-△△CT方法的推導(dǎo)(詳見實(shí)時(shí)定量PCR和2-△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量)
　　
　　補(bǔ)充：在DNaseI消化樣品RNA中的DNA后，需要對(duì)樣品重新進(jìn)行氯仿抽提，具體實(shí)驗(yàn)流程如下：
　　
　　消化后總體積10Oul，體積太少，不利于抽提，我們往往補(bǔ)加200ulDEPC水。
　　
　　1.向離心管中加入等體積氯仿(約300ul)，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現(xiàn)白色片狀沉淀。4℃14000rpm離心8min，取上清(約250ul)。
　　
　　2.加入1/10體積的NaAC(3M)(約25ul)和預(yù)冷的等體積異丙醇(約280ul)，-20℃放置20min。
　　
　　3.4℃14000rpm離心15min，去上清，注意不要觸到沉淀。
　　
　　4.加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm離心3min，去上清。
　　
　　5.瞬時(shí)離心，用200ul(或10ul)的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(tài)(勿吸到管底的沉淀)。
　　
　　6.把離心管放置于超凈臺(tái)晾至約5-10分鐘(勿完全干燥，否則很難溶)。加入30~50μl的無RNase的水，靜止1min后，振蕩30sec，瞬時(shí)離心。
　　
　　7.將提取的RNA立即進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，或放-20℃保存。