四種活細胞提取技術(shù)概括

 

2017年4月28日發(fā)表于 NANOTECHNOLOGY雜志。

 

最新的貼壁活細胞提取技術(shù)——Cytosurge多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT

 

為什么要進行活細胞提��？
   在傳統(tǒng)的細胞提取技術(shù)中往往使用化學(xué)、生物學(xué)方法將細胞裂解，使細胞內(nèi)容物滲出從而達到提取目的。但這類方法必須破壞細胞本身，在進行時效研究中，往往要將細胞分組分時處理，這類方法始終無法克服由于細胞異質(zhì)性帶來的誤差。[1,2]
   全新的活細胞提取技術(shù)解決了這一問題。這種技術(shù)使用微型注射器能夠從細胞的特定部位每次僅提取極少量的胞質(zhì)或者胞核（pL級），從而保證細胞活力的同時獲得足夠分析的細胞質(zhì)或者細胞核，實現(xiàn)對同一細胞不同時間點變化的監(jiān)測，克服傳統(tǒng)法中由于細胞異質(zhì)性帶來的誤差。[1,3]

活細胞提取的4種常用技術(shù)

1. 納米拖網(wǎng)

   這項技術(shù)由Cao等人[2-5]的實驗室建立。在他們的實驗中，他們將150 nm直徑氧化鋁管制成納米拖網(wǎng)。隨后將細胞種植在這種拖網(wǎng)表面。通過這些管道能夠?qū)①N在表面的細胞膜刺破，從而讓細胞內(nèi)容物滲入到下層的提取緩沖液中，這一方法能夠使約7%內(nèi)容物滲透入緩沖液中。他們指出這種方法得到的提取液能夠用于熒光蛋白、酶測定以及PCR等試驗。在他們研究中發(fā)現(xiàn)使用這種納米拖網(wǎng)對iPSc誘導(dǎo)心肌細胞的中mRNA的提取分析實驗中。他們成功分析出44個mRNA序列，而用傳統(tǒng)裂解方法僅能夠分析出7個。

2. 細胞微注射玻璃針
   細胞微注射玻璃針主要用于對大細胞進行注射。這種方法主要是用0.5~5 μm的玻璃管直接從細胞內(nèi)抽取內(nèi)容物。然而這種方法往往會造成細胞損傷，因此目前也有實驗室開發(fā)出100 nm的注射針進行提取。[4,6,7]Actis等[4]使用離子電導(dǎo)顯微鏡結(jié)合微注射玻璃針建立了fL級細胞內(nèi)容物提取方法。在這種方法中他們使用一種含有有機相的微注射玻璃針，通過壓力來移動有機相從而實現(xiàn)提取。他們所建立的方法能夠僅提取HeLa細胞內(nèi)的RNA、線粒體DNA表達物而不提取任何細胞器。

3. FluidFM
   流體力顯微鏡使用中空的原子力探針，通過力學(xué)探測精準(zhǔn)可控的刺穿細胞膜。隨后通過對施加負(fù)壓從而提取細胞。Guillaume-Gentil等報告指出，使用這項技術(shù)提取高達90%的細胞胞質(zhì)的極端條件下，細胞在5天內(nèi)仍保持較高活力。另外他們還使用該技術(shù)同時對細胞核和細胞質(zhì)進行提取并進行酶測定和PCR實驗取得成功。[1,8]

4. 碳納米管
   碳納米管目前主要應(yīng)用于低損傷細胞監(jiān)控中。Singhal等人將50 μm長的多壁碳納米管的末端與微孔玻璃管相連，從而提取胞漿中熒光標(biāo)記的Ca離子。但是目前該方法提取的體積很小，其應(yīng)用仍然受到限制。[5]

總結(jié)：
   盡管當(dāng)下有許多其他方法可以評估細胞內(nèi)環(huán)境，包括熒光標(biāo)記、量子點、納米粒子， FRET，熱敏熒光標(biāo)記抗體或RNA。這些方法能夠提供高特異性、高對比度和高分辨率，但是都只能識別少量預(yù)先設(shè)定的目標(biāo)，無法全面監(jiān)測細胞內(nèi)環(huán)境變化。同時外源材料的引入也存在著對細胞活力產(chǎn)生不利影響的風(fēng)險。[3]
   相比之下，細胞活體提取技術(shù)有著這些方法無法比擬的優(yōu)勢。這種技術(shù)能夠在全面的監(jiān)測細胞內(nèi)環(huán)境變化的同時，還能夠盡可能的維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本文所介紹的4種技術(shù)也有各自的優(yōu)缺點：納米拖網(wǎng)能夠提供較大的細胞提取量，但是無法選擇所需提取的細胞，并且對于不同細胞的提取量差異較大。而細胞微注射玻璃針操作復(fù)雜，所需使用的玻璃針會直接影響注射品質(zhì)。FluidFM技術(shù)使用方便，能夠準(zhǔn)確定位，但該項技術(shù)較新，目前使用人數(shù)不多。碳納米管目前仍受制于其提取量的制約，仍有待發(fā)展。[9-10]

參考文獻
[1] O. Guillaume-Gentil et al., Cell 166, 506 (2016).
[2] Y. Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E1866 (2017).
[3] J. Liu, J. Wen, Z. Zhang, H. Liu, Y. Sun, Microsys. Nanoeng. 1,15020 (2015).
[4] P. Actis et al., ACS Nano 8, 546 (2014).
[5] R. Singhal et al., Nat. Nanotechnol. 6, 57 (2011).
[6] W. Kang, R. L. McNaughton, H. D. Espinosa, Trends Biotechnol. 34, 665 (2016).
[7] Y. Nashimoto et al., ACS Nano 10, 6915 (2016).
[8] A. Meister et al., Nano Lett. 9, 2501 (2009).
[9] C. Chiappini et al., Nat. Mater. 14, 532 (2015).
[10] A. M. Xu et al., Nat. Commun. 5, 8 (2014).