單細胞分離和轉移的新用法——單個細胞級別的分離和轉移

 

 

 

 

 

2014年10月30日發(fā)表于Lab on a Chip雜志。
 

 

   在當代生物學與醫(yī)學的研究中，對單個細胞的分離一直有著很高的需求。然而傳統(tǒng)手段往往需要將大量細胞懸浮后進行分選接種。這類方法不僅費時費力，而且細胞活力也會受到影響。本篇報道中Guillaume使用FluidFM BOT建立了一種非常簡易、快速的新手段。

 

   由于蛋白和基因的隨機表達性，即使同一基因源的細胞也可能會有所不同。因此單細胞分離對于克服細胞異質性有著十分重要的意義。能夠讓研究者從一群混合細胞群中挑選特定感興趣的細胞，之后既可以用于單細胞分析，也可以用于單克隆擴增。這種檢測手段能夠檢測到常規(guī)細胞檢測手段所不能發(fā)現(xiàn)的細胞群中的多樣性。

   另外對于細胞轉染、感染、注射的實驗來說，選取單個細胞對于建立特定基因或表達特定蛋白的克隆來說更是十分必要的。因為只有單一基因的細胞群才能最大限度的保持種群穩(wěn)定。

   在目前的研究中，分離單細胞的手段主要是通過將細胞懸浮后做高通量篩選。其中主要使用的是流式細胞熒光分選技術（FACS）或者免疫磁性細胞分選法（MACS）。這兩種方法在臨床上目前均廣泛應于細胞篩選。然而這兩種方法均需要使用相當大量數量的細胞，一般在105-106數量級上。然而很多研究中，培養(yǎng)出的細胞不太容易達到這個數量級。而在少量細胞分選中，這兩種方法均面臨著極大地挑戰(zhàn)。

   微流控芯片技術的出現(xiàn)讓少量細胞分選有了新的選擇，該方法主要通過熒光、磁力、流體動力流、聲光電泳、介電泳粘附等性質進行分離。這種方法往往需要較低的細胞濃度來實現(xiàn)單細胞分離，因此在分離過程中需要嚴格控制進入微流控芯片中的細胞量。

   上述的分離方法有著廣泛的應用，但是其應用卻也受到其本身性質的應用。因為無論是哪種方法都僅限于操縱懸浮溶液中的細胞。而對于本身還處在貼壁狀態(tài)的細胞卻需要將其完全解離后才能處理。對于目前的研究，絕大部分的哺乳類細胞任然需要貼壁培養(yǎng)。但是卻鮮有成熟的方法能夠用于這種分離方式。

 

   流體力學顯微鏡（FluidFM）是將微量注射與原子力顯微鏡技術相結合的最新型顯微鏡。它能夠在細胞表面實現(xiàn)精準的移動和fL級的流體移動控制。因此在技術層面上擁有非常優(yōu)越的單細胞操縱能力。

   因此Guillaume等首先對FluidFM對單細胞噴灑胰酶的消化能力進行了考察。他們將胰酶噴灑在細胞上方，再觀測細胞消化程度隨時間的變化。通過他們的研究，他們研究了壓力與淋撒體積之間的關系、胰酶作用時間與消化范圍之間的關系、胰酶淋撒壓力與消化面積之間的關系如圖1所示。

圖1，胰酶釋放控制對細胞消化的影響。A）胰酶釋放兩樣與壓力脈沖參數之間的關系；B）胰酶作用時間與消化細胞面積之間的關系（200mbar，10s）；C）細胞消化面積與時間之間的關系（200mbar，10s）；D）最終消化面積與施加壓力的對應關系。

 

 

 

   而對于懸浮細胞的分選工作，F(xiàn)luidFM也能夠輕松應對。首先Guillaume對單個細胞進行了轉移實驗。經過實驗發(fā)現(xiàn)以ΔP = -100 mbar條件對細胞進行吸取，即可將細胞吸入移液槍中。隨后將探針轉移至新的微孔中再以ΔP = +1000 mbar作用1-2s即可將細胞吐出。在之后的培養(yǎng)中也可觀測到細胞貼壁生長，說明這種分選對細胞沒有損傷，如圖4A所示。

   而后他們對細胞進行了連續(xù)分選，將形態(tài)相似的細胞放入同一小室，如圖4B所示。以及根據熒光標記不同分別放入不同小室，如圖4C所示。使用這種方法分選一樣簡單可靠。

圖4細胞分選 A）對活細胞進行分選并記錄圖像。在分選后1小時，細胞開始貼壁生長；B）連續(xù)對細胞進行分選，并放置到同一個小孔中。C）根據染色標記將不同染色的細胞分類放置在不同小室中。

 

   FluidFM是一種強大的分離單細胞的強大手段，通過使用光學手段甄選出感興趣的細胞后，就能夠使用FluidFM技術對其分離，并且不會對細胞造成損傷，能夠保證所分離的細胞最大限度的存活。這種方法的應用將會給生物和醫(yī)學研究提供極大地幫助，尤其對于單克隆細胞群的建立或單細胞的下游分析。

 

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