利用MD微孔板讀板機對細(xì)胞內(nèi)氧化自由基吸收能力(ORAC)進行分析

引言

活性氧簇 (Reactive oxygen species， ROS) 是由細(xì)胞內(nèi)正常代謝反應(yīng)，環(huán)境壓力 以及紫外輻射產(chǎn)生的一類物質(zhì)，包括過氧 自由基、羥基自由基、超氧離子和單線態(tài) 氧。氧化自由基吸收能力 (oxygen radical absorbance capacity，ORAC) 分析是一 種用來評估生理液、食品、飲料以及天然 產(chǎn)物抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法，它可以定量 檢測樣品清除自由基的能力。通常自由基 能夠與細(xì)胞內(nèi)組分發(fā)生反應(yīng)，破壞正常組 織，引起基因突變，破壞細(xì)胞周期正常運 轉(zhuǎn)，導(dǎo)致癌癥和其他疾病。
這里我們展示的是如何利用 Molecular Devices 熒光微孔板讀板機 Gemini™ XPS 及SoftMax Pro 軟件聯(lián)合 Cell Biolabs 的 OxiSelect™ ORAC Assay 來檢測不同果汁 的抗氧化能力，并突出了該方法簡單易行 的特點。

檢測原理

該檢測是基于由偶氮二異丁脒鹽酸鹽 (2, 2’-azobis-2-methyl-propanimidamide dihydrochloride，AAPH) 熱解產(chǎn)生的過氧 自由基，在氧自由基吸收物質(zhì)存在的條件 下與熒光素反應(yīng)，從而影響熒光信號強度 這一原理的。氧自由基吸收物質(zhì)的能力越 強，清除的過氧自由基也就越多，熒光信 號持續(xù)的時間也就越長。為了獲得待測樣 品的抗氧化能力，可在熒光強度對時間作 圖的曲線中，計算樣品曲線下方的 區(qū)域面 積，并扣除空白樣品曲線下方的區(qū)域面積 得到結(jié)果。最終結(jié)果以一種維生素E的類 似物 Trolox™ 的抗氧化能力表示。

材料

• Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑 盒，Part No. STA-345
• MD 熒光微孔板讀板機 Gemini™ XPS
• Greiner FLUOTRAC™ 200 全黑微孔板
• 待測樣品：白蔓越橘汁，白葡萄汁，橙汁， 石榴汁，藍(lán)莓汁，紅酒

方法

以下步驟根據(jù) Cell Biolabs OxiSelect ORAC Assay 試劑盒中的操作流程建立。

試劑制備

熒光素探針制備：將試劑盒中所提供的熒光 素探針用所提供的分析稀釋液稀釋 100 倍， 混勻后標(biāo)記為 1×熒光素工作液。
分析稀釋液制備：分析稀釋液按 1:4 的比 列用去離子水稀釋混勻，稀釋后的液體可 為所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋所用，4℃保存。 樣品制備：果汁和紅酒樣品預(yù)先 4℃ 離心 10 分鐘 (5-10,000 x g) 去除顆粒，隨后上 清在分析檢測前稀釋 100 到 1000 倍。

抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

所需標(biāo)準(zhǔn)品濃度可通過稀釋 1000 μM 的抗 氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品儲液來獲得，現(xiàn)配現(xiàn)用。濃 度梯度稀釋關(guān)系如表 1 所示，零濃度 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品可作為空白對照。
注：每個標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品均需要準(zhǔn)備 2 或 3 個復(fù)孔用于分析。每次分析都需要新鮮配 制標(biāo)準(zhǔn)品。

分析步驟

1. 25  μL 抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入 96 孔板 中，每個樣品 2 個復(fù)孔。
2. 每孔加入 150 μL 1×熒光素工作液，微孔 板充分混勻后放入預(yù)熱的微孔板讀板機中 37℃ 孵育 30 分鐘。
3. 用多道移液器移取 25 μL 自由基起始液至 每孔中。
4. 加入自由基起始液后立即震板 15 秒以便混 勻液體。微孔板在讀板前需在儀器上震板 5 秒。
5. 利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板 機 Gemini™ XPS 讀取每孔的動力學(xué)熒光信 號。在 SoftMax Pro 軟件中激發(fā)光波長設(shè)為 485 nm，發(fā)射光波長設(shè)為 520 nm，cutoff 設(shè)為 515 nm。微孔板一次整板讀取時間為 1 分鐘，總共持續(xù) 60 分鐘。
注：到分析結(jié)束時，最終熒光信號強度應(yīng)小 于初始熒光強度的 10%，否則應(yīng)提高樣品的 稀釋倍數(shù)重新檢測。

結(jié)果計算

1. 利用 SoftMax Pro 軟件計算每個樣品和標(biāo) 準(zhǔn)品的曲線下方區(qū)域面積 (Area under the curve，AUC)。
2. 每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的凈 AUC 應(yīng)當(dāng)通過扣 除空白對照的 AUC 獲得。
3. 以凈 AUC 值為縱軸，Trolox 抗氧化劑標(biāo) 準(zhǔn)品濃度為橫軸作圖。
4. 待測樣品的 Trolox 濃度當(dāng)量 ( TE，單位 μM ) 可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得，結(jié)果用 μM TE/mL 表示。

結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及數(shù)據(jù)分析均采用 SoftMax Pro 軟件處理。Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品的動力學(xué)曲線如圖 1 所示。每個標(biāo)準(zhǔn)品的凈 AUC 通過扣除空白 對照的 AUC 獲得。圖 2 顯示的是每個 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品的凈 AUC 對濃度作圖獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲 線。所有樣品都需要計算凈 AUC。從 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線算出每個樣品的 ORAC 值⸺以 Trolox 濃度當(dāng)量 ( TE，單位 μM ) 表示，并 乘以各自的稀釋倍數(shù)算出最終 ORAC 值， 單位 μMTE/mL。稀釋 100 倍的樣品的信號 值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，稀釋 1000 倍的樣品 的信號值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，其 ORAC 值如 表 2 所示。待測樣品中紅酒的 ORAC 值最高， 而的白蔓越橘汁 ORAC 值最低。需要注意的 是來自不同制造商生產(chǎn)出的產(chǎn)品的組分可能 不同，會引起樣品 ORAC 值的不同。

總結(jié)

利用 Molecular Devices 熒光微孔讀板機 Gemini™ XPS 可以方便地進行 Cell Biolabs 的 OxiSelect™ ORAC 分析，同時儀器配套 的 SoftMax Pro 軟件可以自動計算結(jié)果并 完成標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。
需要注意的是 Molecular Devices 其他多 功能微孔板讀板機如 （SpectraMax M2、 M2e、M3、M4、M5、M5e、Paradigm®） 以及 FilterMax™ F5 都能夠提供熒光檢測 模式，且都可以進行OxiSelect ORAC 分 析。FlexStation® 3 臺式多功能微孔讀板 機還能夠進行自動化加樣。
StakMax® 微孔板堆板機可與 SpectraMax Gemini 系列以及 M 系列微孔讀板機整合使 用以提高通量。

References

1. Huang, D., Ou, B., and Prior, R.L. (2005). The chemistry behind antioxidant capacity assays. J. Agric. Food Chem. 53, 1841-1856.
2. Wang, H., Cao, G., and Prior, R.L. (1996). Total antioxidant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem. 44, 701-705.