細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的檢測(cè)方法

        中國微生物菌種查詢網(wǎng)   細(xì)胞培養(yǎng)中最令人頭疼的問題之一是支原體的污染。在人們?nèi)粘Ｉ�活工作環(huán)境中，支原體無處不在，它可以通過人的毛發(fā)、口腔、穿著的衣服、動(dòng)物的皮毛以及日常的細(xì)胞培養(yǎng)的操作環(huán)境造成對(duì)細(xì)胞污染。
據(jù)說有11%的細(xì)胞株均受到不同程度的支原體污染，更有統(tǒng)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)期的影響。而支原體污染的癥狀不如細(xì)菌、真菌、霉菌污染比較容易辨認(rèn)，一般需要借助其他手段，如PCR、熒光染色試劑盒、培養(yǎng)菌落等方法。

造成細(xì)胞污染的支原體有很多，但主要有四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體和萊氏無膽甾原體。由于支原體體積很小，直徑約在0.2-2.0um之間，可以通過濾膜而直接造成培養(yǎng)基或血清的污染。另外，被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)基液體往往并不渾濁，細(xì)胞受損程度并不明顯，形態(tài)很少改變，這樣就更增加 了人們對(duì)其的防范難度。

從形態(tài)結(jié)構(gòu)上，支原體形態(tài)多變，它多吸附在細(xì)胞表面或散于細(xì)胞與細(xì)胞之間。從其理化或生物學(xué)特性上講，所有支原體代謝均需膽固醇，部分需要精氨酸和葡萄糖。支原體的生存要求比細(xì)菌高，同時(shí)，除需基本營養(yǎng)物質(zhì)外，還需10-20%血清，最適pH值在7.8-8.0之間，多數(shù)支原體呈兼性厭氧，其繁殖方式主要是二分裂繁殖，分裂和其DNA復(fù)制不同步，可形成多核長絲體。

由于支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的微生物，因此它對(duì)作用于細(xì)胞壁類的抗生素（如青霉素G）不敏感。支原體對(duì)熱的抵抗力和細(xì)菌相似，而對(duì)環(huán)境滲透壓的變化比較敏感。支原體對(duì)細(xì)胞的影響，可以從兩方面考慮。一方面是對(duì)細(xì)胞的直接影響，細(xì)胞被支原體污染后，增殖緩慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁上脫落，部分細(xì)胞雖然表面變化不十分明顯，實(shí)際上潛伏著多方面的危險(xiǎn)。另一方面，支原體可以通過消耗培養(yǎng)基中的精氨酸，抑制細(xì)胞DNA、RNA的合成，降低細(xì)胞的抵抗力。因此，支原體污染對(duì)細(xì)胞的影響是非常廣泛和深遠(yuǎn)的。

由于支原體種類不同，應(yīng)采取不同的方法進(jìn)行檢測(cè)，常用的方法有如下幾種：

1、觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長特征：支原體污染比較嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)生長減慢，有的培養(yǎng)基pH明顯變酸，并出現(xiàn)細(xì)胞病變，其病變特征與病毒感染相似，因此不能準(zhǔn)確診斷。
2、分離培養(yǎng)法：大多數(shù)支原體可出現(xiàn)特有的典型菌落。該方法準(zhǔn)確、可靠，但時(shí)間長。 但其實(shí)驗(yàn)周期較長，所以常用于進(jìn)行對(duì)懷疑細(xì)胞的最后甄別。
3熒光染色法（DNA染色法）：此法快捷、簡便、價(jià)廉，但其靈敏度有一定欠缺，易造成漏檢，若細(xì)胞片制備不當(dāng)則結(jié)果難以判斷。
4、PCR法檢測(cè)支原體：最為快速、靈敏，取樣量少，既可進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)也可進(jìn)行細(xì)胞上清的檢測(cè)，同時(shí)可以檢測(cè)8種支原體的污染，是目前常用的檢測(cè)手段。但其成本較高，條件要求嚴(yán)格，有時(shí)易出現(xiàn)假陽性。
5、電子顯微鏡和免疫電子顯微鏡法：此法非常直觀、準(zhǔn)確，但對(duì)使用環(huán)境要求高，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期較長，敏感性不高，常作為樣品的最后定性檢測(cè)。
6、間接免疫熒光法和免疫印跡：簡便、快速、特異性強(qiáng)，如果應(yīng)用單克隆抗體試劑，效果會(huì)更好。
7、其他方法 ：放射性核素?fù)饺敕�、放射自顯影法、基因探針法等。