全基因組甲基化定量檢測技術(shù)-ＬＵＭＡ

 
 
LUMA介紹
基因組DNA甲基化(Genomic DNA Methylation, GDM)的變化被認(rèn)為是正常和病理細(xì)胞過程中的重要的事件，有助于正常發(fā)育和分化以及癌癥和其他疾病。在此，我們介紹一種新的方法評估全基因組DNA甲基化，稱為熒光甲基化檢測(Luminometric Methylation Assay，LUMA)。該方法采用甲基敏感限制性內(nèi)切酶DNA裂解法聯(lián)合焦磷酸測序的聚合酶延伸分析。該方法是一種定量檢測技術(shù)，重現(xiàn)性高，易于推廣。
其優(yōu)點(diǎn)是：無需亞硫酸鹽修飾，無需引物，無需PCR過程，測序反應(yīng)無需磁珠等試劑，十分鐘左右即可完成測序反應(yīng)，方便快捷。而且，該實(shí)驗(yàn)只需要200-500 ng的基因組DNA，并包含一個內(nèi)控以消除起始DNA數(shù)量不同的問題。整個實(shí)驗(yàn)過程能夠在6個小時內(nèi)完成。
 
技術(shù)原理
此方法由Karimiet等人于2006年建立，采用DNA甲基敏感或不敏感的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行DNA裂解，隨后進(jìn)行生物熒光聚合酶延伸試驗(yàn)，以定量限制性裂解的程度。此實(shí)驗(yàn)使用了對CpG甲基敏感的限制酶HpaII及其對甲基不敏感的同裂酶MspI做平行反應(yīng)。EcoRI被用在所有反應(yīng)中作為內(nèi)參。
MspI和HpaII酶切靶序列為CCGG，其CpG位點(diǎn)數(shù)量占整個基因組中CpG位點(diǎn)的8%，可以作為評估全基因組甲基化水平的一個標(biāo)志物。MspI和HpaII裂解后形成5’CG粘末端,而EcoRI生產(chǎn)5′AATT粘末斷,然后通過聚合酶延伸逐步填充苷酸。隨著dNTP的成功延伸，無機(jī)焦磷酸(PPi)被釋放并通過ATP硫酸化酶和5’磷酰硫酸腺苷（APS)作用下轉(zhuǎn)化為ATP。隨后熒光素通過熒光素酶和ATP產(chǎn)生一定比例的可見光并由CCD檢測。
 
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 酶切：每例樣本分為2份DNA，分別用HpaII+EcoRI或MspI+EcoRI雙酶切，酶切約4hr。
2. 純化：酶切產(chǎn)物純化回收。
3. 焦磷酸測序（Pyrosequencing），反應(yīng)過程如下：
dNTPs按四個步驟添加(步驟1:dATPαS,第二步:dGTP + dCTP,第三步:dTTP和步驟4:dGTP +dCTP)。峰值對應(yīng)dATPαS(步驟1)和dTTP(步驟3)的添加，都代表EcoRI裂解，因此兩者應(yīng)該是等值的。因此,dTTP峰用作dATPαS峰的質(zhì)控。第2步，dCTP和dGTP一起添加，對應(yīng)的峰值代表HpaII或MspI裂解。在步驟4中，再次添加dCTP和dGTP作為內(nèi)控完成第二步，因此其相應(yīng)的峰值應(yīng)該是零或接近零。
 
 
 
甲基化率（%）計算：如下圖

 
甲基化率={1-[HpaII(C+G)/EcoRI(A)]/[MspI(C+G)/EcoR(A)]}×100, 上圖中樣本甲基化GDM=57.12%
 
 
技術(shù)應(yīng)用及優(yōu)化
LUMA法自Karimiet等人建立以后，已經(jīng)到到廣泛應(yīng)用，特別是最近幾年表觀遺傳學(xué)研究的深入，此法往往配合NGS、甲基化芯片等技術(shù)對實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行不同層面的表觀遺傳檢測。在應(yīng)用過程中，該方法也在不斷的被評估和改進(jìn)。

• Carolina Soriano-Ta´ rraga等提出此方法受DNA抽提方法的影響，同一樣品抽提方法 不同得到的甲基化率有差異。但對于同樣抽提方法的樣品來說還是有比較好的使用價值的。
• Sofia Lisanti等提出EcoRI內(nèi)切酶具有“star activity”效應(yīng)，即非特異性切割（受Buffer濃度和切割時間影響）和切割不充分（對于EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC的甲基化影響酶切活性），所以作者提出使用與EcoRI有類似酶切位點(diǎn)的MunI替代。
• Claudia Knothe等人使用MunI同裂酶MfeI作為內(nèi)控，并且提出峰值計算新公式：即用A峰和T峰的平均值替代原公式中的EcoRI(A)。

 
參考文獻(xiàn)：

• Mohsen Karimi, et al, LUMA (LUminometric Methylation Assay)—A high throughput  method to the analysis of genomic DNA methylation. EXPERIMENTAL CELL RESEARCH 312(2006)1989–1995

2. Carolina Soriano-Ta´rraga, et al, DNA Isolation Method Is a Source of Global DNA Methylation Variability Measured with LUMA.Experimental Analysis and a Systematic Review.PLOS ONE, April 2013,Volume 8,Issue 4,e60750

• Sofia Lisanti，et al.Comparison of Methods for Quantification of Global DNA Methylation in Human Cells and Tissues. PLoS ONE 8(11): e79044. 
• Claudia Knothe,et al.Disagreement between two common biomarkers of global DNA methylation. Clinical Epigenetics (2016) 8:60
• Karilyn E. Sant,et al.DNA Methylation Screening and Analysis.  Methods Mol Biol. 2012 ; 889: 385–406.
• Regan Vryer,et al.What’s in a name? Context-dependent significance of ‘global’ methylation measures in human health and disease.Clinical Epigenetics (2017) 9:2
• Chowdhury et al.Technical advances in global DNA methylation analysis in human cancers. Journal of Biological Engineering (2017) 11:10
• Li et al.Clinical implications of genome-wide DNA methylation studies in acute myeloid leukemia.  Journal of Hematology & Oncology (2017) 10:41
• Florence K. Crary-Dooley,et al.A comparison of existing global DNA methylation assays to low-coverage whole-genome bisulfite sequencing for epidemiological studies. EPIGENETICS 2017, VOL. 12, NO. 3, 206–214
• Nojima et al.Correlation between global methylation level of peripheral blood leukocytes and serum C reactive protein level modified by MTHFR polymorphism: a cross-sectional study. BMC Cancer (2018) 18:184

 
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