植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)測定試劑盒說明書
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)測定試劑盒
Plant PEPCase Assay Kit
● 產(chǎn)品組成：
● 產(chǎn)品簡介：
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的關(guān)鍵酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸，在植物和細(xì)菌中廣泛存在，在動物及絲狀霉菌中缺乏此酶。此酶是變構(gòu)酶，主要功能為三羧酸循環(huán)提供草酰乙酸， 另外也與 C4 植物光合二氧化碳固定反應(yīng)及景天科植物的蘋果酸形成 (景天酸代謝 )等有關(guān)。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)檢測試劑盒檢測原理如下：在弱堿條件下，PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA)；OAA 在蘋果酸脫氫酶(MDH)催化下被 NADH 還原為蘋果酸 (Mal) 。在堿性條件下每吸收 1 分子 CO2伴隨 1 分子 NADH 氧化，通過分光光度計(jì)測定處吸光度的變化，計(jì)算出 NADH 的消耗速率，進(jìn)一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。
該試劑盒主要用于檢測植物樣本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
按照一次使用1 ml 提取緩沖液計(jì)算，試劑盒可以使用100次。
● 自備材料：
植物材料；剪刀；液氮；研缽或其他研磨設(shè)備；1ml石英比色皿；紫外分光光度計(jì)；制冰機(jī)；低溫離心機(jī)
● 操作步驟：
一、 即用型PEPCase提取緩沖液配制：
注：1. 即用型PEPCase提取緩沖液盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，短期4℃中可以過夜保存。
二、 PEPCase樣品提取：
1. 取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，液氮中研磨，1 cm2葉片（1分硬幣大�。┗�0.1g葉片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取緩沖液，顛倒混勻，冰浴放置5-10分鐘。
2.12000g4℃離心 5分鐘，上清即為PEPCase提取液，冰浴放置備用。
注：提取液最好立即測定，不建議保存。
三、PEPCase活性測定分析：
1. 即用型酶溶解緩沖液配制：
按照標(biāo)簽所示，在試劑6-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液，冰浴備用，-20℃保存。
2. 試劑3-PEP：按照標(biāo)簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
3. 試劑4-NADH：按照標(biāo)簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：NADH穩(wěn)定性較差，用后-20℃貯存3-4天，長期-80℃保存。
4. 試劑5-MDH：按照標(biāo)簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，徹底混勻后冰浴備用。
5. 反應(yīng)體系設(shè)定：
5. 反應(yīng)體系測定；
1.5 ml離心管中配制以下反應(yīng)
注意： = 1 \* GB3 ① 一般分光光度計(jì)OD340讀數(shù)在0.5-3之間數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確，低于此范圍說明提取用的材料太少，酶活性太低；高于此范圍說明所用材料太多，酶活性太高，此時可以將PEPCase樣品提取液用即用型PEPCase提取緩沖液稀釋后測定。
= 2 \* GB3 ② 該反應(yīng)系統(tǒng)是利用速率變化，求得相應(yīng) OD 的變化，進(jìn)而推算出 NADH 的消耗速率，再進(jìn)一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase樣品提取液后立即計(jì)時很重要，每次檢測指標(biāo)不宜過多，否則有可能由于操作時間有差異進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果偏差。
四、PEPCase活性計(jì)算：
根據(jù)如下公式計(jì)算樣品中PEPCase活性：
1. 根據(jù)葉片面積的計(jì)算公式：
Activity（μmol·m-2·S-1）=
=
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應(yīng)最初1分鐘內(nèi)340nm處測定管吸光度變化的絕對值，△A=A0-A1
N-稀釋倍數(shù)，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)
d-cm 比色皿光程，一般為1 △t-秒 測定時間，本程序?yàn)?0秒 S-cm2 提取時使用的葉面積
2. 根據(jù)葉片鮮重的計(jì)算公式：
Activity（μmol·g-1·S-1）=
=
Activity（μmol·g-1·S-1）-表示每秒每克鮮重葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應(yīng)最初1分鐘內(nèi)340nm處測定管吸光度變化的絕對值，△A=A0-A1
N-稀釋倍數(shù)，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)
d-cm 比色皿光程，一般為1
△t-秒 測定時間，本程序?yàn)?0秒
g- 提取時使用的葉片鮮重
● 產(chǎn)品組成：
| 組分貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 貯存 | 運(yùn)輸 |
| RTU4062-01 | 試劑1-PEPCase提取緩沖液（2×） | 100 ml | 短期4℃，長期-20℃ | 常溫 |
| RTU4062-02 | 試劑2-PEPCase Assay buffer(10×) | 15 ml | 短期4℃，長期-20℃ | 常溫 |
| RTU4062-03 | 試劑3-PEP（100×） | 1 ml | -20℃ | 常溫 |
| RTU4062-04 | 試劑4-NADH（100×） | 1.2 ml | -20℃ | 常溫 |
| RTU4062-05 | 試劑5-MDH（100×） | 2 KU | -20℃ | 常溫 |
| RTU4062-06 | 試劑6-酶溶解緩沖液 | 5 ml | -20℃ | 常溫 |
| BSA-02 | 試劑7-BSA溶液 50mg/ml | 5 ml | -20℃ | 常溫 |
| DT0140P | 試劑8-1MDTT（100×） | 1 ml | -20℃ | 常溫 |
| DE005 | 試劑9-滅菌水 | 100 ml | 4℃ | 常溫 |
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的關(guān)鍵酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸，在植物和細(xì)菌中廣泛存在，在動物及絲狀霉菌中缺乏此酶。此酶是變構(gòu)酶，主要功能為三羧酸循環(huán)提供草酰乙酸， 另外也與 C4 植物光合二氧化碳固定反應(yīng)及景天科植物的蘋果酸形成 (景天酸代謝 )等有關(guān)。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)檢測試劑盒檢測原理如下：在弱堿條件下，PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA)；OAA 在蘋果酸脫氫酶(MDH)催化下被 NADH 還原為蘋果酸 (Mal) 。在堿性條件下每吸收 1 分子 CO2伴隨 1 分子 NADH 氧化，通過分光光度計(jì)測定處吸光度的變化，計(jì)算出 NADH 的消耗速率，進(jìn)一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。
該試劑盒主要用于檢測植物樣本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
按照一次使用1 ml 提取緩沖液計(jì)算，試劑盒可以使用100次。
● 自備材料：
植物材料；剪刀；液氮；研缽或其他研磨設(shè)備；1ml石英比色皿；紫外分光光度計(jì)；制冰機(jī)；低溫離心機(jī)
● 操作步驟：
一、 即用型PEPCase提取緩沖液配制：
| 一個反應(yīng)配制體積 | n個反應(yīng)配制體積 | |
| 1 ml | n×1 ml | |
| PEPCase提取緩沖液（2×） | 500 μl | n×500μl |
| 滅菌水 | 470 μl | n×470 μl |
| 1 M DTT（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| BSA溶液50mg/ml | 20 μl | n×20μl |
二、 PEPCase樣品提取：
1. 取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，液氮中研磨，1 cm2葉片（1分硬幣大�。┗�0.1g葉片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取緩沖液，顛倒混勻，冰浴放置5-10分鐘。
2.12000g4℃離心 5分鐘，上清即為PEPCase提取液，冰浴放置備用。
注：提取液最好立即測定，不建議保存。
三、PEPCase活性測定分析：
1. 即用型酶溶解緩沖液配制：
按照標(biāo)簽所示，在試劑6-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液，冰浴備用，-20℃保存。
2. 試劑3-PEP：按照標(biāo)簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
3. 試劑4-NADH：按照標(biāo)簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：NADH穩(wěn)定性較差，用后-20℃貯存3-4天，長期-80℃保存。
4. 試劑5-MDH：按照標(biāo)簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，徹底混勻后冰浴備用。
5. 反應(yīng)體系設(shè)定：
| 加入順序 | 組份 | 1ml反應(yīng)體系加入量 （測定1個樣品） |
MasterMix配制 （測定n個樣品為例） |
| 1 | 10×PEPCase Assay Buffer | 100 μl | n×100 μl |
| 2 | 滅菌水 | 870 μl | n×870 μl |
| 3 | NADH溶液（100×） | 10 μl | n×10μl |
| 4 | PEP溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 5 | MDH溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
1.5 ml離心管中配制以下反應(yīng)
| 1 | 2 | |
| 對照反應(yīng) | 樣品活性測定 | |
| MasterMix | 975 μl | 975 μl |
| 即用型PEPCase提取緩沖液（步驟一） | 25 μl | - |
| PEPCase樣品提取液 （步驟二） |
- | 25μl |
| 混勻后加入到1 ml比色皿中，立即計(jì)時，此時吸光度為A0，每隔 10s 測定一次吸光度，其中至 1min 時處吸光度記為A1，記錄其變化。 |
= 2 \* GB3 ② 該反應(yīng)系統(tǒng)是利用速率變化，求得相應(yīng) OD 的變化，進(jìn)而推算出 NADH 的消耗速率，再進(jìn)一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase樣品提取液后立即計(jì)時很重要，每次檢測指標(biāo)不宜過多，否則有可能由于操作時間有差異進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果偏差。
四、PEPCase活性計(jì)算：
根據(jù)如下公式計(jì)算樣品中PEPCase活性：
1. 根據(jù)葉片面積的計(jì)算公式：
Activity（μmol·m-2·S-1）=
=Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應(yīng)最初1分鐘內(nèi)340nm處測定管吸光度變化的絕對值，△A=A0-A1
N-稀釋倍數(shù)，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)
d-cm 比色皿光程，一般為1 △t-秒 測定時間，本程序?yàn)?0秒 S-cm2 提取時使用的葉面積
2. 根據(jù)葉片鮮重的計(jì)算公式：
Activity（μmol·g-1·S-1）=
=Activity（μmol·g-1·S-1）-表示每秒每克鮮重葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應(yīng)最初1分鐘內(nèi)340nm處測定管吸光度變化的絕對值，△A=A0-A1
N-稀釋倍數(shù)，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)
d-cm 比色皿光程，一般為1
△t-秒 測定時間，本程序?yàn)?0秒
g- 提取時使用的葉片鮮重
標(biāo)簽：
(PEPCase)測定試劑盒
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