磁珠法RNA pull-down 的經(jīng)典操作流程

采用鏈霉親和素磁珠（PuriMag G-strep 貨號PMG015）進行RNA pull-down 

RNA pull-down assay using Streptavidin magnetic beads 

1. RNA pull-down 第一天——生物素探針標(biāo)記RNA

1）前期準(zhǔn)備：取出Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit，將試劑盒中的PEG及DMSO置于常溫，其余組分置于冰上融化，也可將PEG放于37攝氏度融化；打開PCR儀；

2）依照RNA母管含量，用DEPC水溶解RNA，我們通常是10ug/管，用10μl DEPC水溶解。同時溶解試劑盒中Control RNA作為陰性對照；

3）取對照RNA及目標(biāo)RNA各5 μl,放于200 μl的PCR管中，每管可加1 μl DMSO，混勻后置于PCR儀上，85℃，5min,然后立即置于冰上5min;（DMSO的加入可有助于打開RNA的二級結(jié)構(gòu)，提高RNA ligation的效率）

4）按照下表配制探針標(biāo)記反應(yīng)的體系：

成分                                                  體積（μl）    

water                                                         3
10X RNA ligase recation buffer                      3
RNase inhibitor                                           1
Non-labeled RNA                                         5

Biotinylated Cytidine Bisphosphate                1
T4 RNA Ligase                                            2
PEG 30%                                                  15
Total                                                        30

5）混勻上述反應(yīng)體系，之后放至PCR儀內(nèi)， 16℃，4h至過夜。反應(yīng)時間的延長可提高連接效率；

6）連接反應(yīng)結(jié)束后，向每管加400μl nuclease free-water;

7）每管加300 μl酚氯仿提取標(biāo)記成功的RNA；渦旋后最大轉(zhuǎn)速離心15min,小心將上層水相移取到新的EP管中；

8）加10 μl 5M NaCl ,2 μl糖原，以及600 μl 預(yù)冷的100%乙醇，放于-20℃或-80℃沉淀，可沉淀過夜。


2. RNA pull-down 第二天

1）前期準(zhǔn)備

·DTT ，蛋白三聯(lián)室溫溶解；
·streptavidin magnetic beads;(S1420, New England Biolabs)
·RNase Inhibitor;
·細(xì)胞，10cm大皿若干，長至約80~90%密度；


2）RNA抽提

a)將沉淀過夜的RNA取出，4℃，最大轉(zhuǎn)速離心30min，離心后可見管底的白色沉淀，及為RNA；

b)小心移取上清，用1ml 70%乙醇洗滌,8000rpm 離心10min,之后吸凈管內(nèi)液體，空氣中晾干RNA，若乙醇未揮發(fā)完全，將影響下游實驗效率；

c)每管加20 μl nuclease free-water溶解RNA，之后將RNA放于PCR儀中，95℃，5min使其變性，之后立即置于冰上，備用。

3）細(xì)胞裂解

a)棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗3次，吸去上清；

b)每個大皿中加入200μl cell lysis buffer A (加蛋白三聯(lián))；

c)用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，收集至EP管，液氮中三凍三融；

d)離心，4℃，3000rpm，離心10min；

e)轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，置于冰上；可加200U/ml RNase Inhibitor;

f)取10-20 μl左右上清至新管中，作為實驗input組。


4）magnetic beads （PuriMag G-strep 貨號PMG015）預(yù)處理

a)渦旋混勻beads；

b)每管取400μl beads(如本次實驗中，control RNA 及目的RNA各1管)，置于磁力架上，吸去上清；

c)用800μl 1X binding & washing buffer ,洗3次，吸去上清；


5）RNA 與beads結(jié)合

a)向上一步的beads中加入400μl 2X binding & washing buffer；

b)向上一步中加入20μl RNA ,再補380μl DEPC水，使其終體積為800μl；

c)室溫慢速旋轉(zhuǎn)20min,使beads與RNA充分結(jié)合；

d)將上一步的管子置于磁力架上，吸去上清；

e)用800μl 1X binding & washing buffer（含RNase Inhibitor, 1U/ μl）,洗3次，吸去上清；

f)用cell lysis buffer A 洗一次beads, 吸去上清，注意不要讓beads干掉。


6）RNA與蛋白相互作用

a)向上一步已處理好的beads中每管加入500μl 細(xì)胞裂解液（第3步）；同時向每管加入RNase Inhibitor, 1U/ μl；

b)4℃慢速旋轉(zhuǎn)2h,使beads與細(xì)胞裂解液充分結(jié)合；

c)磁力架上吸去上清，用400 μl新鮮配制的cell lysis buffer A（+RNase Inhibitor+蛋白三聯(lián)），洗5次beads;

d)吸去上清，用25μl預(yù)冷的0.1% SDS溶液重懸beads，加6.25μl 的5X蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴煮10min.之后立即置于冰上5min,再置于磁力架上吸取上清至新的EP管中，準(zhǔn)備蛋白上樣。


7）蛋白的檢測

可采用western blot 或質(zhì)譜繼續(xù)下游蛋白的驗證。

以上就是的RNA pull-down技術(shù)的超詳細(xì)秘籍啦！

更多鏈霉親和素磁珠請參考:

 http://www.purimagbead.com/Product/8271042221.html (200nm鏈霉親和素磁珠)

http://www.purimagbead.com/Product/9728163513.html (1um鏈霉親和素磁珠)