使用GC/ICP-MS對生物組織中有機錫化合物進行形態(tài)分析
使用GC/ICP-MS對生物組織中有機錫化合物進行形態(tài)分析
引言
由于有機錫在農業(yè)， 工業(yè)和家庭中被廣泛使用， 因此其對環(huán)境的影響受到了極大的重視[1]。 丁基錫和苯基錫已被廣泛用作活性殺生物劑， 在防污涂料、 聚氯乙烯（PVC） 穩(wěn)定劑、木材處理， 以及其他方面都有應用[2]。 例如， 當被用于防污涂料時， 痕量水平（ppt） 的丁基錫和苯基錫將會對非靶標生物造成嚴重損害， 并在沉積物和生物群中累積[3-4]。 因此， 歐盟（EU） 將三丁基錫（TBT） 及其降解產物列入到優(yōu)先控制污染物名單中（修訂水框架指令2000/60/EC的決定2455/2001/EC） [4]。美國環(huán)境保護署（EPA） 對TBT建立了環(huán)境水生生物水質標準， 其中防止海洋水生生物免受慢性毒作用的標準值是3 ng Sn/L， 而免受急性毒作用的標準值則為172 ng Sn/L[4]。 由于TBT、 三苯基錫（TPhT） 以及它們的降解產物（二取代錫，單取代錫和無機錫） 各自的毒性存在差異， 而且對環(huán)境影響的監(jiān)測也不相同，因而非常有必要對有機錫的形態(tài)進行分析[5]。
如今， 由于氣相色譜-電感耦合等離子體質譜（GC/ ICP-MS） 聯(lián)用法具有靈敏度高， 選擇性好， 可以同時分析多種元素和多種同位素等優(yōu)勢， 因此成為了金屬有機物痕量分析的首選方法[3]。 通過GC/ ICP-MS開展有機錫形態(tài)分析， 為了增加各形態(tài)的揮發(fā)性， 需要加入四丙基硼酸鈉或四乙基硼酸鈉進行衍生化反應。 此外， 對于復雜基質， 如生物組織和沉積物的分析， 在有機錫化合物衍生前需要進行軟提取， 以保持分析物的形態(tài)不發(fā)生改變。 開放微波提取由于具有快速和高效的優(yōu)點， 是最流行的提取方法[3]。 本實驗使用GC/ ICP-MS（CLARUS®GC和NexION®ICP-MS） 對有機錫形態(tài)進行分析， 更具體地說， 是通過外標法對生物樣品中的單丁基錫、 二丁基錫和三丁基錫進行分析。 而且在實驗中特別注意了對連接GC和ICP-MS的GC傳輸線參數(shù)的優(yōu)化。
實驗條件
試劑和化學品
甲基三氯化單錫（MMT， 97％） ， 二甲基二氯化錫（DMT， 97％） ， 三甲基氯化錫（TMT， 97％） ， 三 氯 化 一 丁 基 錫 （MBT ， 95 ％ ） ， 二 氯 化 二丁基錫（DBT， 97％） ， 和三丁基氯化錫儲備溶液（TBT， 96％） 均購自Sigma-Aldrich公司™， 并使用冰乙酸（HAc） （GFS化工） 配制。 使用四丙基硼酸鈉(NaBPr4) (Merseburger Spezialchemikalien, 德國) 進行衍生化。 衍生化過程中使用的緩沖溶液(0.1M, pH 4.9) 由MQ水溶解醋酸鈉和冰乙酸（HAc） 制得。 HPLC級異辛烷和Optima級甲醇（MeOH） 購自Thermo Fisher Scientific™。
高純度的氫氧化銨（NH 4 OH） 、 硝酸（HNO3 ） 、 鹽酸（HCl） 的氫氧化四甲基銨（TMAH， 25％）
均購自GFS化工（GFS Chemicals） 。 在本實驗中使用的標準參考物質貽貝組織（CRM477） 購自標準參考物質和測量研究所（IRMM； 比利時基爾） ， 而牡蠣組織樣品則來自法國阿卡雄灣（Arcachon Bay） 。
儀器
使用PerkinElmer® Clarus 580氣相色譜與NexION 300D電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS） 聯(lián)用進行實驗的分析工作， GC與ICP-MS的連接通過PerkinElmer GC/ICP-MS傳輸線實現(xiàn)（見圖1） 。 將配有一個內失活毛細管柱的Silcosteel®管傳輸線插入到石英炬管和中心管中。 對干式等離子體條件下儀器工作條件（如： 內失活的毛細管柱的距離、 Ar氣組成和氧氣（O2） 流速） 的優(yōu)化進行了評價。 使用一臺SP-D Discover聚焦微波系統(tǒng)（CEM公司， 美國北卡羅萊納州馬修斯）從基質中提取有機錫。 儀器操作條件詳見表1。 使用NexION ICP-MS和 Chromera® CDS軟件完成數(shù)據(jù)的收集和分析。
樣品制備
樣品制備， 微波萃取和衍生化均已有文獻資料記載[3-4]。甲基錫和丁基錫的儲備溶液（1000微克/毫升） 使用濃
的冰醋酸制備。 工作溶液使用1% HCl將貯備溶液按比例進行稀釋得到， 每日現(xiàn)配， 并低溫保存。 標準系列各標準溶液重復測定3次后得到校準曲線。 對于衍生化，稱取大約4.4克乙酸鈉， 加入1.0毫升醋酸， 然后使用MQ水溶解并定容至500mL， 配制成醋酸鹽緩沖溶液(0.1M, pH 4.9)。 此外， 使用MQ水配制2.5% 的NaBPr4溶液作為衍生化試劑， 并于暗處保存。
微波萃取
在對貽貝和牡蠣組織中有機錫化合物進行微波萃取時， 分別在10mL提取小瓶中加入0.15 g干樣， 然后再向干樣中加入4 mL 25% TMAH。 在每個提取小瓶中加入1個小的磁力攪拌棒， 以保證萃取過程中漿液的充分均勻化。 微波消解后， 根據(jù)需要， 可以對樣品進行離心， 然后將上清液轉移到干凈的小瓶中， 并在冰箱中儲存， 待測。 本實驗使用的微波程序詳見表2.
衍生程序
在20 mL玻璃小瓶中進行衍生化。 首先， 將5mL的醋酸鹽緩沖液分別加入到已加入20， 50， 100和200μL含有5 ng / mL有機錫的標準工作溶液中。 根據(jù)需要， 使用HCl或NH4OH將各溶液的pH值調至5.0。 然后向小瓶中加入1mL異辛烷和250μL 2.5％的NaBPr4， 蓋好瓶蓋，并手動振搖5分鐘。 然后將有機相轉移到GC小瓶中進行分析。 以相同的方式制備3個空白溶液， 一方面可以進行檢出限測定， 另一方面也可以發(fā)現(xiàn)樣品制備過程中可能發(fā)生的任何污染的特征。 對于生物組織的分析， 分別將30μL的貽貝組織和300μL的牡蠣組織提取液加入5毫升緩沖液， 并使用HCl或NH4OH將溶液的pH值調至5.0。 然后， 分別向小瓶中加入1mL的異辛烷和500μL的2.5％NaBPr， 蓋好瓶蓋， 并手動振搖5分鐘。 將有機相轉移到GC小瓶中進行分析。 圖2概述了本實驗樣品制備過程的流程。
在清潔的條件下工作對于低濃度分析的成功是非常重要的。 容器均使用洗滌劑進行清洗， 然后分別用硝酸和鹽
酸浸泡（10％V： V， MQ水） ， 不同酸浸泡后使用MQ水沖洗。 清洗完成后， 將容器置于層流罩下干燥保存， 待用。
結果與討論
操作參數(shù)的優(yōu)化主要涉及GC輸送線和ICP-MS炬管， 如內毛細管柱距離， Ar組成氣流速（即霧化氣） 和氧氣（O2） 的加入， 分別使用載氣氦（He） 的氮氣（N2）雜質（同位素15） 連續(xù)信號進行評估。 O2的添加是必要的， 以防止異辛烷在ICP-MS采樣錐產生積碳[5]。 雖然本實驗使用15N+的響應值進行優(yōu)化， 在之前的研究中還有使用氙氣/氬氣混合氣（50ppm） 的報道[6]。
PerkinElmer提供的GC傳輸線， 可用于CLARUS或 AutoSystem ™ GC ， 也可用于CLARUS 或AutoSystem™GC與NexION或ELAN®的ICP-MS平臺的聯(lián)用。 CLARUS GC系統(tǒng)對GC傳輸線的溫度進行控制， 以維持傳輸線中的分析物處于氣相， 并防止出現(xiàn)冷點[7]。 Ar氣流速由ICP-MS霧化器控制， 并在進入傳輸線前進行加熱。 足夠的流量對于待測物質有效的傳送到等離子體中是很重要的。 通過三通（“T” 加入）氧氣， 而且氧氣同樣要通過傳輸線。 儀器設定完成后點炬， 測定15N+響應值， 并根據(jù)15N+響應值進行優(yōu)化。根據(jù)前期的工作， O2氣加入量和內失活毛細管柱位置的優(yōu)化值（距離傳輸線中Silcosteel®管末端的相對位置） 分別為0.025 L/min 和 7 cm[7]。 通過在0.8-1.0 L/min 范圍內改變Ar組成氣（O2流量為0.025 L/min）氣流量， 當觀察到5N+響應值最大時， 確定最優(yōu)Ar組成氣氣流量。 在確定好最優(yōu)條件后， 注入有機溶劑（例如， 異辛烷， 己烷， 丙酮等） ， 以確保待測物質能夠進入等離子體。 圖3為注入異辛烷時5N+同位素信號典型的相應圖。 5N+基線信號在2.5分鐘時的抑制正好與有機溶劑在等離子體中的燃燒相對應， 從而證明了GC氣體流滲透進入到等離子體中。 GC/ICP-MS系統(tǒng)的最優(yōu)條件列于表1。
分析性能
使用丁基錫標準溶液確定分析響應特性。 Sn同位素（118， 119和120） 校正曲線的生成由重復三次注射1µL的標準溶液得到， 標準溶液的濃度范圍從0（即空白） 到2 ng/mL， 使用異辛烷溶液配制。由 120Sn響應函數(shù)（圖4） 可見校準曲線具有良好的線性度和令人滿意的相關系數(shù)（R 2值） 。 檢出限（LOD=3σblank/m） 則由每個校準響應函數(shù)得到，并且120Sn的MBT、 DBT 和 TBT的絕對檢出限分別為18， 200和7 fg。 DBT的絕對檢出限較高可能是因為空白紙較高， 而空白值高則與化學品制備過程中使用的容器和試劑所造成的污染有關。 這種現(xiàn)象很常見， 因為DBT被用于工業(yè)合成塑料。
色譜分離和方法驗證
圖5a-c分別顯示了用異辛烷配制的0.25 ng / mL的標準溶液、 牡蠣組織和標準參考物質貽貝組織中有機錫（120Sn同位素） 各形態(tài)分離的色譜圖。 再方法的開發(fā)過程中對多個Sn同位素（118， 119， 120） 進行了監(jiān)測， 但為簡單起見， 僅列出了120Sn的結果。 色譜條件（表1） 的選擇主要是按照使各形態(tài)物質從溶劑洗脫物干擾區(qū)域分離的方式的進行[1]。 存在于生物組織樣品中的丁基錫化合物的定量結果通過外標法得到。 一式三份提取的貽貝組織標準參考物質用于本實驗方法的驗證。 將實驗測得的MBT， DBT和TBT值與認證值進行比較， 結果列于表3。 雖然牡蠣組織樣本中丁基錫形態(tài)物質的濃度值沒有被標定， 但由圖3還是可以看見其實驗濃度值。 表1中列出的溫度程序為機錫化合物的有效分離提供了保證， 可以在不到11分鐘的時間里完成分離， 而且峰寬為2-3s。 圖5a為優(yōu)化條件下用異辛烷配制的含有甲基錫、 丁基錫形態(tài)物質（質量數(shù)為120） ， 濃度為0.25 ng / mL的標準溶液的色譜圖。 通過圖5b和圖5c， 可以看見牡蠣和貽貝組織的色譜分離圖中還有其它在環(huán)境樣品中常見的有機錫形態(tài)物質的存在， 如：一辛基錫、 二辛基錫、 一苯基錫、 二苯基錫、 三苯基錫等。 色譜圖中所有的峰型都能清楚的被識別。 8.5分鐘時出現(xiàn)的峰型可能是由于NaBEt的雜質造成， NaBEt4是在衍生化階段加入的試劑， 這些雜質可能會使得有機錫的形態(tài)物質生成乙基化產物。 還需要開展進一步工作以證實這些物質。
結論
本文提出了使用GC傳輸線聯(lián)接CLARUS GC和NexIONICP-MS檢測系統(tǒng)成果對生物組織進行分析的方法。 丁基錫的形態(tài)具有良好的線性響應函數(shù)， 在完成參數(shù)優(yōu)化后， 確定了儀器LODs。 將有機錫化合物的GC色譜分離應用于貽貝組織標準參考物質和牡蠣組織的分析。用外標法對生物組織中丁基錫形態(tài)的定量和驗證， 本實驗得到的回收率≥92％， 相對標準偏差≤14％。
參考文獻
1. Aguerre, S., Pécheyran, C., Lespes, G., Krupp, E.,Donard, O.F.X., Potin-Gautier, M. J. Anal. At. Spectrom.16, (2001), 1429.
2. De Carvalho Oliviera, R., Erthal Santelli, R., Talanta82 (2010), 9.
3. Monperrus, M., Rodríguez Martin-Doimeadios, R.C.,Scancar, J., Amouroux, D., Donard, O.F.X. Anal.Chem. 75, (2003), 4095.
4. Jiménez Moreno, M., Pacheco-Arjona, J., RodríguezGonzález, P., Preud’Homme, H., Amouroux, D.,Donard, O.F.X. J. Mass Spectrom. 41, (2006), 1491.
5. Rodriguez Pereiro, I., Schmitt, V.O., Szpunar, J.,Donard, O.F.X., Lobinski, R. Anal. Chem. 68,(1996), 4135.
6. Castro, J., Tessier, E., Neubauer K., and Donard,O.F.X., “Mercury speciation in biological tissues andsediments by GC-ICPMS”, PerkinElmer Application Notes(www.perkinelmer.com), 2012.
7. Bouyssiere, B., Szpunar, J., Lobinski, R.,Spectrochimica Acta Part B. 57, (2002), 805.
