NAT NEUROSCI：轉(zhuǎn)錄組+蛋白組聯(lián)合，揭示microRNA調(diào)控靶點(diǎn)與功能機(jī)制

 基因水平的研究發(fā)現(xiàn)miR-137與多種神經(jīng)精神疾病存在相關(guān)性。同時(shí)，miR-137在正常的神經(jīng)發(fā)生與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中也具有重要作用。但是，miR-137的體內(nèi)功能與作用機(jī)制仍然不清楚。為了揭示miR-137的功能，該研究構(gòu)建了miR-137 KO動(dòng)物，并對(duì)KO動(dòng)物的突觸可塑性、學(xué)習(xí)能力等多種神經(jīng)功能的損傷進(jìn)行了評(píng)價(jià)。借助于轉(zhuǎn)錄組+蛋白組聯(lián)合分析，研究者進(jìn)一步鑒定出phosphodiesterase 10a(Pde10a)是miR-137的重要調(diào)控靶點(diǎn)。

文獻(xiàn)小筆記

Partial loss of psychiatric risk gene Mir137 in mice causes repetitive behavior and impairs sociability and learning via increased Pde10a

Nature Neuroscience  IF=19.912

原文鏈接：https://www.onacademic.com/detail/journal_1000040907544310_8357.html

研究材料與方法

Mir137-knockout mice

（1）評(píng)價(jià)miR-137KO后神經(jīng)功能受到的影響：

● 突觸可塑性：免疫組化，spinedensities，dendritic length，等

● 學(xué)習(xí)記憶能力：Morriswater maze test，Barnes maze test，long-termpotentiation (LTP)，等

● 重復(fù)行為與社交能力：marbleburyingtest，social interaction test，thethree-chamber test，等

（2）蛋白組分析：

● 技術(shù)：TMT定量

● 樣本：皮層組織

● 組別與重復(fù)：Mir137+/+,Mir137+/–, and Mir137–/–，每組兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)（來(lái)自于兩窩）

（3）轉(zhuǎn)錄組分析：

樣本同蛋白質(zhì)組

（4）轉(zhuǎn)錄組+蛋白組聯(lián)合分析尋找miR-137直接調(diào)控靶點(diǎn)：

Sylamer算法比對(duì)UTR匹配富集結(jié)果與蛋白差異表達(dá)的相關(guān)性，以及進(jìn)一步比對(duì)mRNA差異表達(dá)水平

（5）驗(yàn)證miR-137直接靶點(diǎn)：

luciferase reporter assay，UTR突變

研究?jī)?nèi)容與結(jié)果

1．突觸蛋白免疫組化、樹(shù)突長(zhǎng)度等分析，揭示miR-137 KO可導(dǎo)致神經(jīng)可塑性受損。

Fig. 2 |Loss of miR-137 in the nervous system leads to synaptic overgrowth and impaireddendritic growth in vivo

2．多種行為測(cè)試揭示miR-137 KO可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能失調(diào)。

Fig. 3 | Partial loss of miR-137 leads to the learningand memory deficits.

3．多種行為測(cè)試揭示miR-137 KO可導(dǎo)致社交能力改變。

Fig. 4 | Partial loss of miR-137 causes impaired socialbehaviors in mice

4．轉(zhuǎn)錄組、蛋白組揭示miR-137調(diào)控底物。

蛋白組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Mir137–/–組versus Mir137+/+組, Mir137+/–組versus Mir137+/+組, and Mir137–/–組versus Mir137+/–組，分別篩選到417、94和76個(gè)差異表達(dá)蛋白。這些蛋白與DNA replication, nervous system development, and chromatinremodeling，peptidase activity regulation, acute-phaseresponse, and regulation of neurotransmitter secretion等生物過(guò)程有關(guān)。其中有41個(gè)上調(diào)蛋白和9個(gè)下調(diào)蛋白，被預(yù)測(cè)為miR-137的底物。通過(guò)與RNAseq結(jié)果的進(jìn)一步比對(duì)，41個(gè)上調(diào)蛋白中有37個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的基因，在mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著表達(dá)差異，表明上述基因可能是miR-137通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控模式所直接調(diào)控得底物。

Fig. 5 | Systematic identification of in vivo mRNA targetsof miR-137 by integrating proteomic, transcriptomic, and bioinformaticanalyses.

5．確證Pde10a基因是miR-137的直接調(diào)控底物

在上述37個(gè)基因中，作者挑選了5個(gè)表達(dá)上調(diào)最顯著的蛋白對(duì)應(yīng)的基因，以及5個(gè)神經(jīng)功能相關(guān)基因。采用luciferase reporter assay +UTR突變的方法，證實(shí)Pde10a基因是miR-137的直接調(diào)控底物

Fig. 6 | Pde10a is akey mRNA target of miR-137.

6．后續(xù)研究

抑制Pde10a的表達(dá)能夠減緩miR-137 KO引起的神經(jīng)功能失調(diào)。Pde10a KO可逆轉(zhuǎn)了miR-137 KO引起的神經(jīng)功能失調(diào)。

總結(jié)與擴(kuò)展

該文章思路清晰：圍繞前期基因研究中發(fā)現(xiàn)的可能具有重要作用的miRNA展開(kāi)�；�于KO動(dòng)物模型，首先評(píng)價(jià)了miRNA的生物功能。然后利用多組學(xué)的數(shù)據(jù)，篩選可能的miRNA底物，再利用經(jīng)典方法進(jìn)行直接底物驗(yàn)證；最后再評(píng)價(jià)底物被干預(yù)后的表型變化。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)miRNA功能和作用機(jī)制的解析。

其中miRNA底物篩選的方法，值得借鑒。因?yàn)�，常�?guī)通過(guò)序列比對(duì)預(yù)測(cè)出的底物，還是存在很多的不準(zhǔn)確性。而蛋白質(zhì)組的分析可以明確告訴我們，到底哪些蛋白產(chǎn)物確實(shí)發(fā)生了相應(yīng)的表達(dá)變化，蛋白產(chǎn)物的表達(dá)水平是miRNA底物判定的最重要依據(jù)。同時(shí)，如果差異表達(dá)蛋白所對(duì)應(yīng)的mRNA并沒(méi)有相應(yīng)改變，則可進(jìn)一步確定該基因的調(diào)控方式并不是因?yàn)榛�因轉(zhuǎn)錄水平的變化，而是miRNA參與的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控（另外還有一種途徑是miRNA的結(jié)合，引起了mRNA的降解）。所以，在底物預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，蛋白組+轉(zhuǎn)錄組可以更加準(zhǔn)確、有效地篩選miRNA的底物，并提供更全面、更系統(tǒng)的信息。