LED光源在熒光顯微成像中的應(yīng)用簡述

熒光顯微鏡中的LED光源具有便利與綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。這些LED能夠保持研究成分的有效性，特別是對成像和敏感樣品的保存。
LED技術(shù)在我們的生活中發(fā)揮越來越重要的作用。在過去的50年里，該技術(shù)的應(yīng)用已從簡單的電子產(chǎn)品指示燈擴(kuò)展到替代白熾燈以節(jié)約大量能源。LED具有高強(qiáng)度、使用壽命長、可控制性及光譜輸出穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此發(fā)展出了一些不為大家所熟知的專業(yè)照明應(yīng)用。

圖1. 熒光顯微鏡的基本構(gòu)造
將熒光顯微鏡中的燈泡替換成LED已大大降低了其運(yùn)行成本。這種技術(shù)在生命科學(xué)中廣泛用于單細(xì)胞或多細(xì)胞生物標(biāo)本的研究。該研究涉及到使用光學(xué)顯微鏡（圖1）激發(fā)出特定波長的光。通過一種被稱作為斯托克斯（Stokes）位移的過程，例如熒光光譜和拉曼光譜，重新激發(fā)出更長波長的光。斯托克斯位移即相同電子躍遷吸收和發(fā)射光譜帶頂位置之間波長或頻率單元的差異。
使用不同的熒光團(tuán)來標(biāo)記樣品，即在不同的區(qū)域使用不用的熒光顏色，則可形成高對比度的多色照片（圖2）。

圖2. 使用CoolLED公司pE-300white拍攝的帶有熒光標(biāo)記的皮膚圖像
滿足光譜需求
一些研究中需要使用活細(xì)胞成像，另一些需要使用被化學(xué)試劑固定于某一特定生命時(shí)期的細(xì)胞。不論何種情況，用于照明樣本的光源的類型和設(shè)計(jì)對顯微鏡所需的硬件以及所記錄圖像的質(zhì)量和有效性都有極大的影響。
早期使用LED系統(tǒng)的一個(gè)重要原因在于使用者及實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人的便利性。最常見的燈泡，例如100W高壓汞燈，其壽命很短，約為300小時(shí)。使用者通常會在記事本上記錄打開燈泡的時(shí)間，因?yàn)槿羰褂脽襞莸臅r(shí)間過長，則會增加爆炸的風(fēng)險(xiǎn)。然而，LED產(chǎn)品的使用壽命長達(dá)數(shù)萬小時(shí)。

燈泡的使用需要預(yù)熱與冷卻的時(shí)間，且在一整天內(nèi)都要打開。而LED光源可以在需要的時(shí)候以電子方式打開或關(guān)閉，即在觀察樣本或拍照期間打開光源，不使用期間可以關(guān)閉。盡管使用LED替代燈泡的優(yōu)點(diǎn)很多，但由于存在高強(qiáng)度及光譜范圍這兩個(gè)主要問題，LED的應(yīng)用發(fā)展停滯不前。
由于LED光源的復(fù)雜性和成本，其發(fā)出的光不是寬光譜而是包含多達(dá)六個(gè)離散波長的高斯（Gaussian）光譜，并且具有約10nm至40nm的半峰寬（FWHM）。因此光源設(shè)計(jì)人員需要使用多個(gè)LED來滿足研究人員的光譜需求，這將產(chǎn)生新的光電和機(jī)械設(shè)計(jì)的復(fù)雜性，且這些問題對于傳統(tǒng)燈泡光源來說是不存在的。研究人員需要捕捉和校準(zhǔn)LED芯片的朗伯發(fā)射，然后使用二色鏡組合出多種顏色。朗伯定律表明，從漫反射表面觀察到的發(fā)光強(qiáng)度與入射光方向和表面法線之間的角度θ的余弦成正比。
一種新穎且已獲得專利的方法采用了波長分組概念，即具有相近光譜的LED波長為一個(gè)用戶可選擇的通道。根據(jù)對高速應(yīng)用的需求，合并具有相近光譜的四個(gè)LED。關(guān)鍵是要認(rèn)識到，某些波長接近的分組，在相同的樣本中很少會用到。如今，研究人員可以使用包含高達(dá)16個(gè)波長的LED光源，使用這種方法能夠改善LED的強(qiáng)度、譜段范圍，也能夠降低成本。

目前可以使用的LED芯片的功率與100W汞燈泡中等離子弧產(chǎn)生的輻射相差甚遠(yuǎn)。燈泡能夠發(fā)射極寬譜段范圍的能量，但在給定的約20nm的譜段范圍內(nèi)，LED更有優(yōu)勢甚至超過了汞燈泡在360nm至800nm的大部分區(qū)域。
LED的過度使用在熒光應(yīng)用領(lǐng)域非常常見，這使熱量管理變得極為重要。冷卻技術(shù)包括珀?duì)柼�（Peltier）冷卻以及將未封裝的LED芯片放置在大型銅散熱片上。
長期以來，光譜的綠光區(qū)域與燈泡相比最弱，這部分區(qū)域在固態(tài)照明中被稱為“綠色空白”，也是LED光譜中極其微弱的區(qū)域。研究人員可以通過采用多種形式的熒光材料來解決這一問題。一種由飛利浦公司（Philips）取得專利權(quán)的方法使用由一系列明亮藍(lán)色LED組成的熒光棒。與單個(gè)LED相比，在常見的熒光顯微鏡上使用這種方法會增加成本且實(shí)用不方便。對藍(lán)色LED芯片功率的最新研究提出了更為簡單的解決方案，即在LED上直接放置熒光劑，且只選擇能夠提供最大綠色光譜區(qū)域的熒光劑。圖3中展現(xiàn)了由明亮綠色LED通過斯托克斯位移激發(fā)的紅色光。

圖3. 使用熒光標(biāo)記的牛肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞。藍(lán)色區(qū)域?yàn)榧?xì)胞核，綠色區(qū)域?yàn)槲⒐艿鞍祝�紅色區(qū)域?yàn)榧�動蛋白。圖片來源：Jordi Recasens/Izasa Scientific。
成像增強(qiáng)
顯微鏡的最終目標(biāo)是獲取優(yōu)質(zhì)的圖像。然而，由于光毒性的影響，樣品觀測對實(shí)驗(yàn)來說至關(guān)重要。通過提升LED的固有屬性可以同時(shí)改善圖像信噪比以及成像的反作用。
金屬鹵素?zé)粢�入后，充液燈開始廣泛使用，消除了為提高照明均勻度而校準(zhǔn)燈泡的需要。這種均勻度的改善為制造性能良好的光擾頻器起到了指導(dǎo)性作用。LED由于其固態(tài)特性可以直接與顯微鏡連接，無需重新校準(zhǔn)，并采用柯勒（Köhler）照明——一種現(xiàn)代科學(xué)光學(xué)顯微鏡樣品照明技術(shù)。利用這種方法，光源中的光學(xué)器件可將LED成像到顯微鏡物鏡的后孔徑上。這種反向工作的物鏡能夠在樣品的完整視野內(nèi)均勻地分散光線。然而一些LED仍與導(dǎo)光板一起使用，以減輕顯微鏡的重量和振動。
具有良好的阻擋和反射區(qū)域的濾光片能夠改善圖像的信噪比。在用于普通4',6-二脒基-2-苯基吲哚熒光（DAPI）成像（圖4）的激發(fā)和發(fā)射濾光片中，激發(fā)濾光片需要阻擋汞（Hg）光譜大部分藍(lán)色區(qū)域的能量。

圖4表示使用示例性的激發(fā)和發(fā)射濾光片覆蓋385nm LED的光譜以及DAPI吸收和發(fā)射的Hg光譜。
相比之下，用于激發(fā)DAPI的LED在相應(yīng)的激發(fā)帶上產(chǎn)生了極低的能量，包括在相對較弱的樣品成像的藍(lán)色區(qū)域。對比結(jié)果為，使用LED作為光源能夠獲得更好的圖像信噪比，因?yàn)長ED光源能夠減低樣品的背景水平。愛丁堡大學(xué)的Sandrine Prost及其同事們的研究表明采用波長可控制的獨(dú)立LED光源，其信噪比的提高超過了燈泡系統(tǒng)，甚至超過了其他一些白色寬光源LED。
由于細(xì)胞不能暴露在高強(qiáng)度光下，因此觀測樣品也會影響到觀測結(jié)果。觀測樣品導(dǎo)致的反作用包括光漂白和光毒性，導(dǎo)致隨著時(shí)間推移信號減弱和活細(xì)胞的死亡或由照明引起的操作不當(dāng)。減少樣品的照明時(shí)間對降低這些反作用的影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)燈泡光源通過機(jī)械快門來控制曝光，這種方法有時(shí)會造成長時(shí)間的延遲，導(dǎo)致樣品在曝光時(shí)被不必要地照亮。
使用自動控制的LED光源則可以解決這個(gè)問題。LED的直接TTL控制通過提供以微秒計(jì)算時(shí)間的開/關(guān)來完善USB通信方式。許多高端攝像機(jī)在相機(jī)曝光時(shí)使用TTL輸出信號，該信號能夠與相機(jī)曝光精確配合，直接饋送至LED光源控制開關(guān)。由于兩至三個(gè)熒光標(biāo)記的順序成像很常見，所以最新的LED將波長的階躍序列編程到光源中，隨著每個(gè)照相機(jī)的順序進(jìn)行曝光。對于這種電路連接方式，不需要實(shí)時(shí)操控機(jī)械控制的快門以及電腦控制模塊，因而減少了不必要地樣品曝光。
最近，麥吉爾大學(xué)的Claire Brown及其同事們的研究表明，通過控制樣品曝光量，光漂白及光毒性的影響將大大降低。一個(gè)熒光原子吸收一個(gè)光子后將進(jìn)入受激單能態(tài)，理論上將釋放自身大部分的能量，激發(fā)出一個(gè)更長波長的新光子。然而，熒光原子也有可能進(jìn)入有毒的三線態(tài)。如果處于三線態(tài)的熒光原子吸收了更多的光子，則額外的能量會使共價(jià)鍵的斷裂。這種方法同樣有助于降低光毒性和光漂白效果。