關(guān)于噬菌體的培養(yǎng)和應(yīng)用

Q1: 什么是噬菌體展示技術(shù)？
A1:噬菌體展示技術(shù)(phage display technology)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。
 

Q2: 噬菌體展示與其他的抗體開發(fā)技術(shù)相比有什么優(yōu)點(diǎn)？
A2: 與雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體展示技術(shù)具有很大的優(yōu)勢。雜交瘤法僅適用于小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠。另一方面，噬菌體展示可用于包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、雞、駱駝、駱駝、羊駝、牛、狗、綿羊、猴和鯊魚在內(nèi)的所有流行的抗體產(chǎn)生物種產(chǎn)生高親和力單克隆抗體�；�于雜交瘤的單克隆抗體開發(fā)一次只能產(chǎn)生少量針對特定免疫原的抗體，而噬菌體展示技術(shù)可以呈現(xiàn)免疫動(dòng)物的整個(gè)抗體庫，其中幾乎10%的抗體是免疫原特異性。使用噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)具有所需性質(zhì)的抗體的機(jī)會(huì)要大得多。此外，使用雜交瘤技術(shù)，很難結(jié)合能夠選擇性分離具有所需功能的抗體的富集步驟。在大多數(shù)情況下，首先產(chǎn)生所有的雜交瘤克隆，然后逐個(gè)驗(yàn)證。相比之下，噬菌體展示技術(shù)允許各種富集策略：可以富集具有所需性質(zhì)的抗體，從而可以將那些沒有所需功能的抗體排除在進(jìn)一步驗(yàn)證之外。例如，抗體庫篩選可以使用靶捕獲強(qiáng)結(jié)合物同時(shí)使用控制來阻斷/耗盡交叉反應(yīng)結(jié)合物�？傊�，這種免疫抗體庫方法允許收集動(dòng)物體內(nèi)幾乎所有的抗體，并從收集物中分離出最強(qiáng)的結(jié)合物。
 

Q3: M13、T7和T4噬菌體系列的區(qū)別是什么？
A3: M13絲狀噬菌體一直是最流行的選擇，廣泛用于各種類型的研究。病毒外殼由五個(gè)不同的衣殼蛋白組成，包括一個(gè)主要衣殼pVIII（2,700拷貝）和四個(gè)次要衣殼（一端是pIII和pVI，另一端是pVII和pIX）。與T4和T7不同的是，M13是溶原性噬菌體，它在周質(zhì)中組裝，在不裂解宿主的情況下從細(xì)菌膜中分泌出來。M13噬菌體上的多重衣殼蛋白為具有獨(dú)特特性的多種肽和蛋白質(zhì)提供了全面的展示選擇。這五種衣殼都已成功地用于具有獨(dú)特載體的外域顯示。PIII和PVIII是M13噬菌體展示的首要選擇。
噬菌體T4在許多方面不同于M13，T4具有更大的尺寸，尾部結(jié)構(gòu)和編碼50種不同蛋白質(zhì)的雙鏈DNA（dsDNA）基因組，較大的基因組DNA允許更大的外來蛋白的插入。可以在HOC和SOC上顯示兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，這兩種非必需的外殼蛋白�？梢允褂肗-和C-末端插入。在沒有膜分泌過程的情況下，使用T4噬菌體可以避免宿主毒性。
與絲狀噬菌體和λ噬菌體相比，T7噬菌體的生命周期較短。子代噬菌體的組裝在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中，通過細(xì)胞膜裂解而釋放，因此沒有大小限制和分泌過程導(dǎo)致的宿主毒性。此外，T7噬菌體在其他噬菌體不能存活的極端條件下非常穩(wěn)定。
 

Q4: 可以用M13噬菌體展示系統(tǒng)來構(gòu)建cDNA文庫嗎？
A4: 通常M13不適合cDNA表達(dá)，因?yàn)镸13噬菌體展示需要前導(dǎo)序列（分泌所需）和外殼蛋白pIII或pVIII的N末端之間的框內(nèi)表達(dá)。為了將相應(yīng)的蛋白質(zhì)適當(dāng)?shù)厝诤系酵鈿さ鞍字校�插入物必須在兩端的正確閱讀框中并且不包含框內(nèi)終止密碼子。這導(dǎo)致M13 cDNA文庫中產(chǎn)生的克隆數(shù)量極少。
 

Q5: 培養(yǎng)噬菌體可以用什么培養(yǎng)基？
A5: TSB / TSA可用于培養(yǎng)大部分噬菌體。然而，不同的噬菌體展示系統(tǒng)，適合的培養(yǎng)基可以是各種各樣的。
 

Q6: 噬菌體M13可以感染哪種大腸桿菌？ 它是否有機(jī)會(huì)污染我們實(shí)驗(yàn)室中的所有細(xì)胞株？
A6: M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，它使用細(xì)菌F接合菌毛的尖端作為受體來促進(jìn)感染過程。因此，它們僅對含有F質(zhì)粒（F+）的大腸桿菌菌株具有特異性。對于實(shí)驗(yàn)室中的菌株，我們建議您檢查它們是否含有F質(zhì)粒。如果他們不具有，M13噬菌體就不能感染它們。
 

Q7: 大腸桿菌TG1宿主菌是否含有抗生素抗性？
A7: 大腸桿菌TG1菌株不含抗生素耐藥性，而噬菌體感染的TG1菌株可通過2YT-AK培養(yǎng)基（2YT含100μg/mL氨芐青霉素、50μg/mL卡那霉素）篩選。
 

Q8: PFU和CFU的區(qū)別？
A8: pfu，指菌斑形成單位，是衡量單個(gè)感染性粒子數(shù)量的單位，通常用于計(jì)算噬菌體。cfu，指的是集落形成單位，是活細(xì)胞的量度，其中集落代表源自單個(gè)祖細(xì)胞的細(xì)胞集合，并且通常用于計(jì)數(shù)細(xì)菌（例如大腸桿菌）。
 

Q9: 怎么判斷構(gòu)建的噬菌體文庫的優(yōu)劣？
A9：從免疫文庫中選擇的抗體親和力與文庫的大小成正比，文庫庫容越大，抗體親和力越好。通常，最終庫容的大小應(yīng)該達(dá)到10⁸。它足夠大以分離高親和力抗體。此外，作為一個(gè)優(yōu)質(zhì)文庫，它應(yīng)該具有高度的多樣性。最終文庫的QC結(jié)果表明，所有隨機(jī)挑選的克隆均未發(fā)現(xiàn)共同的序列，表明文庫的多樣性處于很高的水平。