Armored CAR-T細(xì)胞療法之IL-18的抗癌療效
CAR-T療法作為最有前景的腫瘤治療方式之一，其抗腫瘤效果離不開T細(xì)胞的活性及擴(kuò)增能力等，上一期我們已經(jīng)介紹關(guān)鍵性細(xì)胞因子的加入會改善T細(xì)胞效力，克服免疫抑制微環(huán)境，提高CAR-T療法在液體瘤乃至實(shí)體瘤的治療效果。今天我們就繼續(xù)介紹這種名為“Armored CAR-T”（裝甲）的細(xì)胞療法，和一種新的助力這種CAR-T的明星分子--- 免疫調(diào)節(jié)因子IL-18。
首先，我們一起了解一下什么是Armored CAR-T？
Armored CAR-T：Armored譯為裝甲，即賦予CAR-T細(xì)胞一個裝備使其更加強(qiáng)大。具體是指在第二/第三代CAR-T 的基礎(chǔ)上共表達(dá)一些關(guān)鍵的細(xì)胞因子或共刺激配體，即第四代CAR-T[1]。
意義：不管是血液瘤還是實(shí)體瘤，CAR-T細(xì)胞活性短、低增殖、抑制腫瘤微環(huán)境會抑制T細(xì)胞活性，細(xì)胞因子或共刺激配體的加入起可以到免疫調(diào)節(jié)作用，顯著提升T細(xì)胞擴(kuò)增活性和壽命，錦上添花。
舉例： IL-12：系統(tǒng)注射IL-12細(xì)胞因子會引起嚴(yán)重的炎癥，但共表達(dá)IL-12的第四代CAR-T細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)局部表達(dá)后，可在腫瘤病灶處招募NK細(xì)胞，或者直接逆轉(zhuǎn)被耗竭的腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞，從而有效克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境，并能增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如下圖為共表達(dá)IL-12的Armored CAR-T可以提高CAR-T功效[1]。
由于目前以共表達(dá)細(xì)胞因子居多，因此狹義的四代CAR-T即Armored CAR-T可理解為共表達(dá)細(xì)胞因子，廣義上為表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子，如表達(dá)CD40L（TNFR家族的CD40配體）和4-1BBL（共刺激配體），它們可以對抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行額外的共刺激，增強(qiáng)T細(xì)胞活性[1]。下圖為表達(dá)4-1BBL，共刺激受體4-1BB/4-1BBL可促進(jìn)T細(xì)胞增殖，促使DC細(xì)胞活化并分泌細(xì)胞因子，并提升細(xì)胞溶解能力。
因此，CAR-T設(shè)計(jì)中加入細(xì)胞因子（IL-7，IL-15、IL-18以及IL-21等），可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖活化以及殺傷功能。繼上一期我們已經(jīng)了解了IL-7的免疫功效，本期就先為大家介紹一下細(xì)胞因子IL-18的功能及與腫瘤免疫的關(guān)系。
IL-18（interleukin-18，IL18）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)其活性，近年來其在抗腫瘤、抗感染以及免疫調(diào)節(jié)方面的作用更是被廣泛研究，這些都為CAR-T效力的提升以突破傳統(tǒng)局限提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)。下面一起來了解一下IL-18的免疫功能吧。
一、 IL-18的發(fā)現(xiàn)
IL-18發(fā)現(xiàn)于1995年，因可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，被稱為干擾素誘導(dǎo)因子（IFN-γ Inducing Factor, IGIF），隨后發(fā)現(xiàn)其還有促進(jìn)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的產(chǎn)生和降低IL-10的產(chǎn)生等功能，被重新命名為IL-18，歸屬于IL-1家族。人和小鼠的IL-18主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種免疫和非免疫細(xì)胞也可產(chǎn)生[2]。
二、IL-18信號通路（如下圖）
① 存在于細(xì)胞中的IL-18前體，經(jīng)過加工后釋放到胞外；
② 成熟的IL-18與受體復(fù)合物IL-18Rα/IL-18Rβ結(jié)合；
③ 最終激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生促炎因子。
IL-18主要通過產(chǎn)生IFN-γ來調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的應(yīng)答，這種調(diào)節(jié)依賴于IL-12或IL-15，研究表明，在IL-12/15存在時，IL-18可以誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，而兩者不存在時，則不會誘導(dǎo)或只誘導(dǎo)微量的IFN-γ的產(chǎn)生[3]。
三、IL-18的功能（如下圖[4]）
1. 對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)
① 在 IL-12 的刺激下，IL-18可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖和分泌大量的IFN-γ，更好地清除抗原，尤其是胞內(nèi)的細(xì)菌、真菌和原生動物；
② 在一些其他刺激信號存在時，IL-18 能誘導(dǎo)原始的或者 Th1 極化的細(xì)胞產(chǎn)生Th2 細(xì)胞因子如IL-13；
③ IL-18對于Treg細(xì)胞也有作用，有研究表明 IL-18 可以有效的抑制 Treg細(xì)胞的積累和功能[5]。
2. 對NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)
① 在 IL-12 的刺激下，IL-18可以促進(jìn)NK細(xì)胞中IFN-γ 的合成和分泌；
② IL-18 可以通過增加穿孔素perforin ，TNF和 FASL 的表達(dá)來增加NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性；
③ 對于自然殺傷性 T 細(xì)胞(NKT cells)，IL-18在 IL-12 的協(xié)同作用下可以促進(jìn)自然殺傷性 T 細(xì)胞合成 IFN-γ，在 TCR的刺激下 IL-18 可以增強(qiáng)NKT 細(xì)胞產(chǎn)生 IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、TNF[6]。
另外嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞也可以在IL-18刺激下產(chǎn)生大量的IL-13，釋放化學(xué)調(diào)控因子，如組胺等，來保護(hù)機(jī)體免受外界病原體的干擾。
四、 IL-18的抗腫瘤作用
Micallef在BALB/c小鼠腹腔接種Meth A肉瘤細(xì)胞后，腹腔注射或靜脈注射IL-18表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用。且在接種腫瘤細(xì)胞前3h和6h各用1μg的IL-18預(yù)處理小鼠一次，接種腫瘤的小鼠均能存活，而對照小鼠在3周內(nèi)全部死亡。體外試驗(yàn)表明，IL-18本身沒有抗腫瘤作用，因此其抗腫瘤作用應(yīng)是通過誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞而間接發(fā)揮的。如下圖為IL-18處理后對NK細(xì)胞活性的影響[7]。
IL-18抗腫瘤的機(jī)制究竟是如何發(fā)生的呢？
① 首先激活NK細(xì)胞，分泌大量的IFN-γ，使其能夠特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞；
② NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)下，CD8+T和CD4+T細(xì)胞逐漸活化，CTL發(fā)揮殺傷作用，并且CD4+T細(xì)胞參與腫瘤特異性免疫記憶的形成；
③ 也可通過激活Th細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子增強(qiáng)抗腫瘤效果，如分泌的IL-2可以通過激活單核、巨噬細(xì)胞增強(qiáng)殺傷活性。
五、 IL-18在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用
上述，介于IL-18在免疫調(diào)控中的強(qiáng)大功能，其在腫瘤免疫方面中的應(yīng)用被廣泛研究，與其他細(xì)胞因子相比，IL-18表現(xiàn)出了更強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，且毒副作用更低。主要包括以下幾方面：
應(yīng)用1：一項(xiàng)關(guān)于腎透明細(xì)胞癌的臨床I期研究中[8]，病人被給予不同劑量的rhIL-18（recombinant human IL-18），結(jié)果顯示所有病人皆耐受良好，這也提示病人對IL-18的耐受度比IL-12或IL-2高10-1000倍，反應(yīng)了其低度的優(yōu)良特性。
應(yīng)用2：IL-18基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞體內(nèi)致瘤性下降，動物存活期延長，表明IL-18是一種具有抗腫瘤作用的新因子，為臨床腫瘤治療提供了一種新的安全有效的手段。
應(yīng)用3： Tomura[9]等研究了IL-18對NK細(xì)胞體外作用的特點(diǎn)，IL-18單獨(dú)與NK細(xì)胞共育，只能產(chǎn)生少量IFN-γ，在有IL-12或IL-2存在時，能產(chǎn)生大量的IFN-γ。然而IL-18與IL-12聯(lián)合使用具有較強(qiáng)的毒副作用，可使荷瘤小鼠的體重下降、粘膜糜爛、腹瀉等。實(shí)驗(yàn)提示，這種副作用可能是由于IL-18引起的。因此，明確各個因子的組合及劑量調(diào)整也是一個重要研究方向。
綜上所述，IL-18作為一種免疫調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)分泌IFN-γ，顯著增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)，因此若在CAR-T中裝上細(xì)胞因子IL-18，很可能會增強(qiáng)CAR-T療效，同時還可減少CAR-T細(xì)胞的使用量及全身給藥的副作用。另一方面，IL-18對于NK細(xì)胞的增強(qiáng)效果也為我們今后的CAR-NK提供了新的思路和靶向。本期就到先到這里了，讓我們一起期待IL-18在CAR-T治療上的神奇療效吧！我們下期再見~
參考文獻(xiàn)
1. Yeku O O, Brentjens R J. Armored CAR T-cells: utilizing cytokines and pro-inflammatory ligands to enhance CAR T-cell anti-tumour efficacy[J]. Biochemical Society Transactions, 2016, 44(2): 412-418.
2. Wawrocki, S., et al., Interleukin 18 (IL-18) as a target for immune intervention. Acta Biochim Pol, 2016. 63(1): p. 59-63.
3. Sedimbi, S.K., T. Hagglof, and M.C. Karlsson, IL-18 in inflammatory and autoimmune disease. Cell Mol Life Sci, 2013. 70(24): p. 4795-808.
4. Tsutsui H, Nakanishi K. Immunotherapeutic applications of IL-18[J]. Immunotherapy, 2012, 4(12): 1883-1894.
5. Carroll, R.G., et al., Distinct effects of IL-18 on the engraftment and function of human effector CD8 T cells and regulatory T cells. PLoS One, 2008. 3(9): p. e3289.
6. Uchida, T., et al., IL-18 time-dependently modulates Th1/Th2 cytokine production by ligand-activated NKT cells. Eur J Immunol, 2007. 37(4): p. 966-77.
7. Micallef, M.J., et al., Interleukin 18 induces the sequential activation of natural killer cells and cytotoxic T lymphocytes to protect syngeneic mice from transplantation with Meth A sarcoma. Cancer Res, 1997. 57(20): p. 4557-63.
8. Robertson, M.J., et al., A dose-escalation study of recombinant human interleukin-18 using two different schedules of administration in patients with cancer. Clin Cancer Res, 2008. 14(11): p. 3462-9.
9. Tomura, M., et al., A critical role for IL-18 in the proliferation and activation of NK1.1+ CD3- cells. J Immunol, 1998. 160(10): p. 4738-46.
首先，我們一起了解一下什么是Armored CAR-T？
Armored CAR-T：Armored譯為裝甲，即賦予CAR-T細(xì)胞一個裝備使其更加強(qiáng)大。具體是指在第二/第三代CAR-T 的基礎(chǔ)上共表達(dá)一些關(guān)鍵的細(xì)胞因子或共刺激配體，即第四代CAR-T[1]。
意義：不管是血液瘤還是實(shí)體瘤，CAR-T細(xì)胞活性短、低增殖、抑制腫瘤微環(huán)境會抑制T細(xì)胞活性，細(xì)胞因子或共刺激配體的加入起可以到免疫調(diào)節(jié)作用，顯著提升T細(xì)胞擴(kuò)增活性和壽命，錦上添花。
舉例： IL-12：系統(tǒng)注射IL-12細(xì)胞因子會引起嚴(yán)重的炎癥，但共表達(dá)IL-12的第四代CAR-T細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)局部表達(dá)后，可在腫瘤病灶處招募NK細(xì)胞，或者直接逆轉(zhuǎn)被耗竭的腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞，從而有效克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境，并能增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如下圖為共表達(dá)IL-12的Armored CAR-T可以提高CAR-T功效[1]。
由于目前以共表達(dá)細(xì)胞因子居多，因此狹義的四代CAR-T即Armored CAR-T可理解為共表達(dá)細(xì)胞因子，廣義上為表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子，如表達(dá)CD40L（TNFR家族的CD40配體）和4-1BBL（共刺激配體），它們可以對抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行額外的共刺激，增強(qiáng)T細(xì)胞活性[1]。下圖為表達(dá)4-1BBL，共刺激受體4-1BB/4-1BBL可促進(jìn)T細(xì)胞增殖，促使DC細(xì)胞活化并分泌細(xì)胞因子，并提升細(xì)胞溶解能力。
因此，CAR-T設(shè)計(jì)中加入細(xì)胞因子（IL-7，IL-15、IL-18以及IL-21等），可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖活化以及殺傷功能。繼上一期我們已經(jīng)了解了IL-7的免疫功效，本期就先為大家介紹一下細(xì)胞因子IL-18的功能及與腫瘤免疫的關(guān)系。
IL-18（interleukin-18，IL18）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)其活性，近年來其在抗腫瘤、抗感染以及免疫調(diào)節(jié)方面的作用更是被廣泛研究，這些都為CAR-T效力的提升以突破傳統(tǒng)局限提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)。下面一起來了解一下IL-18的免疫功能吧。
一、 IL-18的發(fā)現(xiàn)
IL-18發(fā)現(xiàn)于1995年，因可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，被稱為干擾素誘導(dǎo)因子（IFN-γ Inducing Factor, IGIF），隨后發(fā)現(xiàn)其還有促進(jìn)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的產(chǎn)生和降低IL-10的產(chǎn)生等功能，被重新命名為IL-18，歸屬于IL-1家族。人和小鼠的IL-18主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種免疫和非免疫細(xì)胞也可產(chǎn)生[2]。
二、IL-18信號通路（如下圖）
① 存在于細(xì)胞中的IL-18前體，經(jīng)過加工后釋放到胞外；
② 成熟的IL-18與受體復(fù)合物IL-18Rα/IL-18Rβ結(jié)合；
③ 最終激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生促炎因子。
IL-18主要通過產(chǎn)生IFN-γ來調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的應(yīng)答，這種調(diào)節(jié)依賴于IL-12或IL-15，研究表明，在IL-12/15存在時，IL-18可以誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，而兩者不存在時，則不會誘導(dǎo)或只誘導(dǎo)微量的IFN-γ的產(chǎn)生[3]。
三、IL-18的功能（如下圖[4]）
1. 對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)
① 在 IL-12 的刺激下，IL-18可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖和分泌大量的IFN-γ，更好地清除抗原，尤其是胞內(nèi)的細(xì)菌、真菌和原生動物；
② 在一些其他刺激信號存在時，IL-18 能誘導(dǎo)原始的或者 Th1 極化的細(xì)胞產(chǎn)生Th2 細(xì)胞因子如IL-13；
③ IL-18對于Treg細(xì)胞也有作用，有研究表明 IL-18 可以有效的抑制 Treg細(xì)胞的積累和功能[5]。
2. 對NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)
① 在 IL-12 的刺激下，IL-18可以促進(jìn)NK細(xì)胞中IFN-γ 的合成和分泌；
② IL-18 可以通過增加穿孔素perforin ，TNF和 FASL 的表達(dá)來增加NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性；
③ 對于自然殺傷性 T 細(xì)胞(NKT cells)，IL-18在 IL-12 的協(xié)同作用下可以促進(jìn)自然殺傷性 T 細(xì)胞合成 IFN-γ，在 TCR的刺激下 IL-18 可以增強(qiáng)NKT 細(xì)胞產(chǎn)生 IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、TNF[6]。
另外嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞也可以在IL-18刺激下產(chǎn)生大量的IL-13，釋放化學(xué)調(diào)控因子，如組胺等，來保護(hù)機(jī)體免受外界病原體的干擾。
四、 IL-18的抗腫瘤作用
Micallef在BALB/c小鼠腹腔接種Meth A肉瘤細(xì)胞后，腹腔注射或靜脈注射IL-18表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用。且在接種腫瘤細(xì)胞前3h和6h各用1μg的IL-18預(yù)處理小鼠一次，接種腫瘤的小鼠均能存活，而對照小鼠在3周內(nèi)全部死亡。體外試驗(yàn)表明，IL-18本身沒有抗腫瘤作用，因此其抗腫瘤作用應(yīng)是通過誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞而間接發(fā)揮的。如下圖為IL-18處理后對NK細(xì)胞活性的影響[7]。
IL-18抗腫瘤的機(jī)制究竟是如何發(fā)生的呢？
① 首先激活NK細(xì)胞，分泌大量的IFN-γ，使其能夠特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞；
② NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)下，CD8+T和CD4+T細(xì)胞逐漸活化，CTL發(fā)揮殺傷作用，并且CD4+T細(xì)胞參與腫瘤特異性免疫記憶的形成；
③ 也可通過激活Th細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子增強(qiáng)抗腫瘤效果，如分泌的IL-2可以通過激活單核、巨噬細(xì)胞增強(qiáng)殺傷活性。
五、 IL-18在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用
上述，介于IL-18在免疫調(diào)控中的強(qiáng)大功能，其在腫瘤免疫方面中的應(yīng)用被廣泛研究，與其他細(xì)胞因子相比，IL-18表現(xiàn)出了更強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，且毒副作用更低。主要包括以下幾方面：
應(yīng)用1：一項(xiàng)關(guān)于腎透明細(xì)胞癌的臨床I期研究中[8]，病人被給予不同劑量的rhIL-18（recombinant human IL-18），結(jié)果顯示所有病人皆耐受良好，這也提示病人對IL-18的耐受度比IL-12或IL-2高10-1000倍，反應(yīng)了其低度的優(yōu)良特性。
應(yīng)用2：IL-18基因轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞體內(nèi)致瘤性下降，動物存活期延長，表明IL-18是一種具有抗腫瘤作用的新因子，為臨床腫瘤治療提供了一種新的安全有效的手段。
應(yīng)用3： Tomura[9]等研究了IL-18對NK細(xì)胞體外作用的特點(diǎn)，IL-18單獨(dú)與NK細(xì)胞共育，只能產(chǎn)生少量IFN-γ，在有IL-12或IL-2存在時，能產(chǎn)生大量的IFN-γ。然而IL-18與IL-12聯(lián)合使用具有較強(qiáng)的毒副作用，可使荷瘤小鼠的體重下降、粘膜糜爛、腹瀉等。實(shí)驗(yàn)提示，這種副作用可能是由于IL-18引起的。因此，明確各個因子的組合及劑量調(diào)整也是一個重要研究方向。
綜上所述，IL-18作為一種免疫調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)分泌IFN-γ，顯著增強(qiáng)Th1型免疫反應(yīng)，因此若在CAR-T中裝上細(xì)胞因子IL-18，很可能會增強(qiáng)CAR-T療效，同時還可減少CAR-T細(xì)胞的使用量及全身給藥的副作用。另一方面，IL-18對于NK細(xì)胞的增強(qiáng)效果也為我們今后的CAR-NK提供了新的思路和靶向。本期就到先到這里了，讓我們一起期待IL-18在CAR-T治療上的神奇療效吧！我們下期再見~
參考文獻(xiàn)
1. Yeku O O, Brentjens R J. Armored CAR T-cells: utilizing cytokines and pro-inflammatory ligands to enhance CAR T-cell anti-tumour efficacy[J]. Biochemical Society Transactions, 2016, 44(2): 412-418.
2. Wawrocki, S., et al., Interleukin 18 (IL-18) as a target for immune intervention. Acta Biochim Pol, 2016. 63(1): p. 59-63.
3. Sedimbi, S.K., T. Hagglof, and M.C. Karlsson, IL-18 in inflammatory and autoimmune disease. Cell Mol Life Sci, 2013. 70(24): p. 4795-808.
4. Tsutsui H, Nakanishi K. Immunotherapeutic applications of IL-18[J]. Immunotherapy, 2012, 4(12): 1883-1894.
5. Carroll, R.G., et al., Distinct effects of IL-18 on the engraftment and function of human effector CD8 T cells and regulatory T cells. PLoS One, 2008. 3(9): p. e3289.
6. Uchida, T., et al., IL-18 time-dependently modulates Th1/Th2 cytokine production by ligand-activated NKT cells. Eur J Immunol, 2007. 37(4): p. 966-77.
7. Micallef, M.J., et al., Interleukin 18 induces the sequential activation of natural killer cells and cytotoxic T lymphocytes to protect syngeneic mice from transplantation with Meth A sarcoma. Cancer Res, 1997. 57(20): p. 4557-63.
8. Robertson, M.J., et al., A dose-escalation study of recombinant human interleukin-18 using two different schedules of administration in patients with cancer. Clin Cancer Res, 2008. 14(11): p. 3462-9.
9. Tomura, M., et al., A critical role for IL-18 in the proliferation and activation of NK1.1+ CD3- cells. J Immunol, 1998. 160(10): p. 4738-46.
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