糖蛋白標(biāo)志物研究工具——凝集素芯片

 
       糖基化是Z為廣泛和復(fù)雜的蛋白質(zhì)共翻譯或翻譯后修飾之一，它是通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶，在新生多肽或者成熟蛋白質(zhì)的特定氨基酸上添加多個(gè)單糖的過(guò)程，通俗的理解就是在細(xì)胞器內(nèi)“出廠”的蛋白質(zhì)上添加各種糖鏈“標(biāo)簽”的過(guò)程。人體內(nèi)至少50%的蛋白質(zhì)都會(huì)發(fā)生糖基化修飾。這類修飾與蛋白質(zhì)的正確折疊、構(gòu)象穩(wěn)定性及分泌等密切相關(guān)，并影響多種生理學(xué)過(guò)程，如分子間識(shí)別、細(xì)胞的粘附、免疫反應(yīng)、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等。
 

 這樣一種重要的修飾“標(biāo)簽”不僅會(huì)因蛋白質(zhì)本身的動(dòng)態(tài)多樣性而在不同類型的樣本中呈現(xiàn)豐度和類別差異，還會(huì)因各種生理或病理?xiàng)l件而在同類型的樣本中發(fā)生變化，表現(xiàn)出高度的復(fù)雜性和異質(zhì)性。那么有沒(méi)有一種工具可以在全局的角度，快速地描繪出樣本總體的糖基化修飾圖譜呢？答案是——凝集素芯片。 
 

 上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科楊藺主任與華盈生物研發(fā)團(tuán)隊(duì)、上海交通大學(xué)陶生策教授課題組一起展開(kāi)合作，以社區(qū)獲得性肺炎為研究對(duì)象，通過(guò)凝集素芯片篩選血清糖基化譜，進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜分析，找到潛在的肺炎血清診斷糖蛋白標(biāo)志物HPR，有助于對(duì)兒童非細(xì)菌性肺炎與細(xì)菌性肺炎的鑒別診斷，相關(guān)研究成果于6月12號(hào)在線發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊《Proteomics - Clinical Applications》上。

       

        
         該研究的論文作者有多名來(lái)自華盈生物研發(fā)團(tuán)隊(duì)，成功應(yīng)用了華盈生物新建立的凝集素芯片-標(biāo)志物研發(fā)方案 ，綜合了蛋白芯片與質(zhì)譜兩種蛋白組學(xué)技術(shù)，為復(fù)雜疾病的臨床標(biāo)志物開(kāi)發(fā)提供了新的研究思路，具有借鑒意義。也充分體現(xiàn)了華盈生物專業(yè)化技術(shù)服務(wù)的理念與研發(fā)實(shí)力。

 

研究思路解析：

 

 

第1步：明確研究目的

社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)是兒童（尤其是嬰幼兒）常見(jiàn)感染性疾病，也是5歲以下兒童死亡的首位病因。CAP常見(jiàn)病原體包括細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體等。但不同病原體感染的嬰幼兒早期癥狀無(wú)明顯差別，傳統(tǒng)的診斷方法存在不足，難以實(shí)現(xiàn)早期及時(shí)有效的診斷，因而臨床上以經(jīng)驗(yàn)性的廣譜抗生素治療為主，導(dǎo)致耐藥以及部分患兒未及時(shí)針對(duì)性用藥而延誤病情的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此臨床上兒童肺炎尚缺乏有效的早期鑒別診斷標(biāo)志物。

 
第2步：凝集素芯片助力血清糖基化譜篩選

前面提到，由于蛋白糖基化修飾的廣泛性，無(wú)論病理?xiàng)l件下特定蛋白本身數(shù)量發(fā)生變化，還是糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控的修飾程度、類型發(fā)生變化，都可能導(dǎo)致樣品中糖鏈“標(biāo)簽”的差異累積并呈現(xiàn)在整體水平上。而凝集素就是一種可以識(shí)別這類“標(biāo)簽”的工具蛋白，制備成蛋白芯片后大大提高了可以同時(shí)檢測(cè)的“標(biāo)簽”通量（詳見(jiàn)后文介紹），因此研究人員從蛋白糖基化篩選入手，應(yīng)用凝集素芯片對(duì)正常兒童(NC)、支原體肺炎患兒(M)和細(xì)菌性肺炎患兒(B)的血清糖基化譜進(jìn)行篩選。芯片結(jié)果顯示，有4個(gè)凝集素（CALSEPA、MIA、PAA 、SNA-I）在不同組間有明顯的差異結(jié)合信號(hào)，在總體水平上反映出不同血清樣品中特定蛋白糖鏈的豐度差異。
 

 

圖1 凝集素芯片篩選糖基化譜

 
第3步：凝集素芯片結(jié)果驗(yàn)證與延伸

其中，研究人員選取SNA-I進(jìn)行l(wèi)ectin blot實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。和芯片檢測(cè)一致，結(jié)果顯示支原體肺炎組檢測(cè)信號(hào)明顯高于正常對(duì)照組和細(xì)菌性肺炎組。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，差異結(jié)合信號(hào)集中在42 kDa分子量附近，推測(cè)該分子量附近的蛋白可能有糖基化的上調(diào)或者蛋白表達(dá)量的上調(diào)。因此研究人員結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)支原體肺炎組中42 kDa附近蛋白表達(dá)量有明顯增加，并且和SNA-I的結(jié)合信號(hào)差異相關(guān)性很高（見(jiàn)圖2），由此推測(cè)SNA-I結(jié)合信號(hào)的差異可能是由于42 kDa附近蛋白表達(dá)量增加導(dǎo)致的。
 

 

 

圖2 lectin blot驗(yàn)證凝集素芯片結(jié)果

 
第4步：關(guān)鍵糖蛋白鑒定

 為了進(jìn)一步明確是哪個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生了上調(diào)，研究人員以凝集素SNA-I為釣餌，進(jìn)行了pull down實(shí)驗(yàn)。血清pull down產(chǎn)物（P-M3）經(jīng)電泳分離后，對(duì)42 kDa分子量附近的蛋白條帶進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示，高同源性蛋白HP和HPR的鑒定分值Z高。隨后通過(guò)western blot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)HPR在支原體肺炎組（M組）中表達(dá)量明顯上調(diào)，如圖3。
 

 

圖3  HPR可能是潛在的肺炎診斷標(biāo)志物 

第5步：HPR標(biāo)志物評(píng)判

        最后，研究人員應(yīng)用western blot技術(shù)對(duì)更多例數(shù)的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：肺炎組的HPR水平要高于健康對(duì)照組（p＜0.001），并且與細(xì)菌性肺炎組相比，HPR表達(dá)水平在非細(xì)菌性肺炎組（支原體肺炎組和病毒性肺炎組）更高（p＜0.05），如圖4。表明HPR可以作為潛在的兒童肺炎診斷指標(biāo)，并且具有針對(duì)兒童細(xì)菌性肺炎與非細(xì)菌性肺炎的鑒別診斷的潛力。
 

 

 

圖4  HPR標(biāo)志物評(píng)判

小科普：揭開(kāi)凝集素芯片的神秘面紗~
       凝集素（Lectin）是一類自然界廣泛存在的蛋白質(zhì)，具有識(shí)別特定糖結(jié)構(gòu)的特性。利用凝集素進(jìn)行糖結(jié)構(gòu)的解析是糖相關(guān)生物學(xué)研究領(lǐng)域的常用手段，迄今發(fā)現(xiàn)超過(guò)300種，并且已有近100多種能通過(guò)商業(yè)途徑獲得。華盈生物提供的凝集素芯片是將商業(yè)途徑獲得的55種經(jīng)典凝集素，以微陣列的形式固定在高分子三維芯片片基上，形成高通量凝集素芯片，可進(jìn)行多種糖結(jié)構(gòu)的同步篩選和交叉驗(yàn)證。隨著近年來(lái)糖組學(xué)研究的興起和蓬勃發(fā)展，越來(lái)越多的蛋白被證實(shí)具有糖基化修飾，同時(shí)其在生命活動(dòng)中的重要性越來(lái)越被認(rèn)可。該芯片的誕生不僅為專注于糖基化相關(guān)研究的科研工作者提供了有力的工具，也為廣大其它研究領(lǐng)域的科研工作者提供了新的研究視角和技術(shù)手段。

 

凝集素芯片特點(diǎn)：

• 芯片基片：高分子三維基片，75*25 mm

• 凝集素種類：55種

• 點(diǎn)體積：0.5~1 nL/點(diǎn)

• 點(diǎn)重復(fù)：3次

• 可檢測(cè)樣品：14個(gè)

 

凝集素芯片應(yīng)用:

• 特定蛋白表面糖鏈結(jié)構(gòu)檢測(cè)

  Functional glycosylation of human podoplanin: Glycan structure of platelet aggregation-inducing factor. （FEBS Lett.  PMID: 17222411）

• 完整細(xì)胞表面糖基化譜檢測(cè)

  Lectin RCA-I specifically binds to metastasis-associated cell surface glycans in triple-negative breast cancer.  (Breast Cancer Res.  PMID: 25848723)

• 組織或細(xì)胞裂解液糖基化差異篩選

  Molecular imaging using fluorescent lectins permits rapid endoscopic identification of dysplasia in Barrett's esophagus. (Nat Med.  PMID: 22245781)

• 唾液樣本糖基化檢測(cè)

  Age- and Sex-Associated Differences in the Glycopatterns of Human Salivary Glycoproteins and Their Roles against Influenza A Virus. (J Proteome Res.  PMID: 23590532)

• 石蠟包埋樣本檢測(cè)

  A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. (Cancer Cell.  PMID: 28609658)（參見(jiàn)案例解析）