流式細胞的數(shù)據(jù)圖如何分析

流式細胞術(shù)( Flow cytometry, FCM)是一種可以對細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)進行快速測量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。與一般的技術(shù)相比，流式細胞儀分析時會涉及到各種參數(shù)，對于剛?cè)腴T的我們，常常搞得焦頭爛額。如下圖（來自網(wǎng)絡(luò)）僅僅流式分析數(shù)據(jù)圖都是多種多樣（一維直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖等）。所以，今天就為大家科普一下，流式細胞儀中那些常見術(shù)語。

01、流式細胞儀常見術(shù)語

1. 設(shè)門（gate）：

劃定某一區(qū)域的細胞群體，對其單獨加以分析或分選。舉例來說，如下左圖，以FSC為橫坐標(biāo)，SSC為縱坐標(biāo)，圈出想進行分析的細胞主群（設(shè)門），雙擊圈內(nèi)，看FL4(APC)為橫坐標(biāo)，F(xiàn)L2(PE)為縱坐標(biāo)，進行分析。下中圖為陰性對照，由此可以圈出陰性群的范圍，在下右圖中就可以劃分出APC單陽、PE單陽、APC&PE雙陽的細胞群。

2. FL1、 FL2、 FL3、FL4通道：

在某些機型的流式細胞儀中存在，是指不同的熒光通道。舉個例子，我們用FITC/PE雙標(biāo)記的細胞，在488nm的激光激發(fā)下，這兩種熒光染料分別發(fā)出波長不同的綠色和橙色熒光，然后將發(fā)出的熒光再通過濾光片分開，對應(yīng)的是不同的波長的濾光片，一般在FL1通道是530nm的濾光片，在FL2通道是575nm的濾光片，這樣就可以把在一起的熒光分開了。

3. FL2-W FL2-A FL2-H ：

流式細胞儀檢測信號時，每一個細胞通過激光，機器的探頭都會檢測到一個熒光信號，在內(nèi)部產(chǎn)生一個電脈沖信號（波），這個信號機器記錄為一個峰值，每一個峰值都有三個參數(shù)，高度（H），寬度（W）和曲線下面積（A），H 和W都是直接測出的，而A是根據(jù)機器的設(shè)置就算得出。

4. APC、PE、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5等：

這些名詞均為常見的熒光素，在受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光。

5. 調(diào)補償：

若兩種以上的熒光素的發(fā)射光譜之間存在重疊，則需要調(diào)補償。這就意味著一種熒光素發(fā)出的光可能被另一種熒光素的檢測器檢測到。調(diào)補償主要指在流式細胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊的過程，去除干擾熒光信號。如下為補償調(diào)節(jié)原則：

①用于調(diào)節(jié)補償?shù)臉?biāo)本必須單染。

②樣本必須可以染出一群陽性和一群陰性，以比較它們之間的平均熒光強度。

③可以使用同一熒光的另一抗體替換目的抗體來調(diào)節(jié)補償（例如在稀有細胞檢測時）。

④使用表達強度高的抗體來調(diào)節(jié)補償。

⑤用來調(diào)節(jié)補償?shù)目贵w必須與實驗用的抗體熒光素一樣（例如不能用FITC調(diào)節(jié)GFP的補償）。

⑥串聯(lián)染料的抗體如果批號不同，需要再次做補償。

⑦陰性和陽性細胞的自發(fā)熒光水平必須一致。

⑧有些抗原表達弱，陽性群不明顯，例如IFN-γ-PE，可以用補償微球代替細胞。

6. MFI值：

即為平均熒光強度。每個細胞經(jīng)過流式細胞儀檢測都會有一個相對強度的熒光值。陰性細胞沒有特異性熒光，也會發(fā)生很微弱的自發(fā)熒光，因此有很小的熒光強度；陽性細胞的特異性熒光強度是陰性細胞熒光強度的幾百甚至幾千倍。MFI就是把所有細胞的熒光強度相加再除以細胞數(shù)，就是所有細胞熒光強度的一個平均值。一般來說，百分比越高MFI就高，百分比低相應(yīng)MFI就低，有時候兩個樣本百分比相處不多看不出差別時，MFI就能很好地反應(yīng)這種微弱的差異。

7. 染色：

用帶有不同熒光基團的抗體分別結(jié)合細胞上不同的抗原。熒光素偶聯(lián)抗體的標(biāo)記（染色）包括表面染色和胞內(nèi)染色：

①表面染色

②胞內(nèi)染色

8. 基線偏移：

通過增加隨機的高斯正偏移把一些低水平信號的對數(shù)數(shù)據(jù)從比較低的數(shù)字通道上移上來，方便數(shù)據(jù)間的分析。

02、常見的技術(shù)指標(biāo)

1. 儀器的分辨率：

分辨率是衡量儀器測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV (Coefficient of Variation)表示。DNA 流式分析中的分辨率（或精確性）非常重要，因為細胞群體之間DNA 含量的細微差別可能有顯著的生物學(xué)意義。通常，分辨率由標(biāo)準(zhǔn)微球DNA 分布中的G0/G1 峰的變異系數(shù)CV來反映（CV%=（SD/Mean）×100）。儀器因素（如液流、光路調(diào)試和光學(xué)元件等）、樣本制備和染色過程帶來的人為因素都可能影響檢測的精確性。評估真正的生物學(xué)意義上的DNA 含量差別因而具有更重要的價值。如何最大限度地減少樣本制備和儀器因素帶來的變異是DNA 分析條件最佳化的根本所在。DNA 直方圖中峰的CV 越低，質(zhì)量越好，從圖中可能獲得的信息越多。新鮮標(biāo)本的CV 常比石蠟包埋的標(biāo)本好。新鮮標(biāo)本的CV 常≤3%，而石蠟包埋的標(biāo)本CV 則取決于組織病理實驗室的具體操作方法，通常到≤5%。當(dāng)G1 峰的CV≥8%時，不再合適估計S 期比例。

2. 熒光測量靈敏度：

靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標(biāo)，一般以能檢測到單個微球上最少標(biāo)有FITC 或PE 熒光分子數(shù)目來表示，一般現(xiàn)在FCM 均可達到<600個熒光分子，兩個細胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。

3. 前向角散射光(FSC, Forward Scatter)檢測靈敏度：

前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM 可以測量到0.2-0.5μm 左右。

4. FCM 分析速度：

分析速度以每秒可分析的細胞數(shù)來表示，當(dāng)細胞流過光束的速度超過FCM 儀器響應(yīng)速度時，細胞產(chǎn)生的熒光信號就會被丟失，這段時間稱為儀器的死時間（Dead time）。死時間越短，我們就說這臺儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達到3000個/秒~6000個/秒左右，F(xiàn)ACS Calibur 的分析速度為10000個/秒，大型機已達到每秒幾萬個細胞。

5. FCM 分選指標(biāo)：

分選指標(biāo)主要包括：分選速度、分選純度及分選得率。分選速度指每秒可提取所要細胞的個數(shù)，目前常用的臺式分選儀器BD公司生產(chǎn)的FACS Calibur的分選速度為300個/秒，BD大型機的流式細胞儀最高分選速度可達每秒上萬個細胞。分選純度指被分選出細胞所占的百分比，一般臺式機和大型機的分選純度均可達到99%左右。分選得率是指被分出細胞與原來溶液中該細胞的百分比。通常情況下，分選純度和得率是互相矛盾的，同一樣品，純度提高，得率降低，反之亦然。這是由于樣品在液流中并不是等距離一個接著一個有序地排著隊，而是隨機的，因此，一旦兩個不同細胞挨得很近時，在強調(diào)純度和收獲率不同條件下，儀器會作出取舍，因此，選擇純度還是得率要視具體實驗要求而定。

6. 背景（噪聲、熒光、散射）Background (noise, fluorescence, scatter)：

當(dāng)樣品流中沒有顆粒時卻仍存在的信號（背景噪聲是限制熒光檢測靈敏度的一個因素）。背景信號會有不同的主要來源：當(dāng)激光器關(guān)閉，或流動室沒有光激發(fā)時，檢測器噪聲是主要的背景信號來源。對于光電倍增管（PMT），檢測器背景噪聲被稱為暗電流，主要來自光電陰極的電子的隨機發(fā)射。對于光電二極管和其他固態(tài)檢測器，主要來源于倍增器。熒光噪聲源包括：水和光學(xué)元件的拉曼散射來自樣品或鞘流中未結(jié)合的熒光染料、試劑或污染物的熒光光學(xué)組件的熒光。

03、Tips

①控制好孵育時間：熒光淬滅操作中的孵育時間一定要嚴(yán)格，孵育時間過長會導(dǎo)致熒光淬滅，如將試管放入冰中，可以延遲淬滅；

②注意染色順序：遇到多種熒光染色時，可能會因為染色順序的不同而導(dǎo)致熒光強度不同。處理方法：提前進行預(yù)實驗，嘗試多種順序，選擇最佳染色順序

③合適的染色方案：選擇不合理的染色方案也會導(dǎo)致熒光信號太弱。處理方法：提前進行預(yù)實驗，設(shè)計好最佳染色方案

④做好陰性對照及同型對照：試驗細胞陰性對照可以顯示細胞基準(zhǔn)的熒光水平。同型對照則是為了查看抗體非特異性結(jié)合的水平。選擇同型對照需要注意采用相同物種、相同亞類、相同染料、相同濃度，否則，檢測的時候會出現(xiàn)亂七八糟的同型對照結(jié)果。

⑤選擇合適的抗體：為表達最弱的抗原選擇染色指數(shù)最高的熒光素。根據(jù)使用的流式細胞儀性能、激光器、濾光片種類來選擇。對于多色實驗，需選擇發(fā)射光譜重疊小的染料。