lncRNA MIR100HG和miR100以及miR125b在CRC抗cetuximab的調(diào)控作用

lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling
 
來源于lncRNA MIR100HG的miR-100和miR-125b通過Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路調(diào)控結(jié)直腸癌的抗西妥昔單抗效果
 
 結(jié)直腸癌（colorectal cancer ,CRC）無論是在發(fā)病率還是在死亡率中都是最高的三類癌癥之一^[1]，早期結(jié)直腸患者沒有癥狀，所以需要通過腸鏡和基因篩查的方法去診斷。西妥昔單抗（cetuximab）和帕尼單抗是表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）單克隆抗體，能夠結(jié)合細(xì)胞外EGFR區(qū)域增強(qiáng)受體的內(nèi)吞和降解，一般可與化療藥物聯(lián)用治療CRC�；颊邔�(duì)cetuximab治療的耐藥和KRAS、NRAS、BRAF、EGFR的基因突變可能有關(guān)，文章通過研究lncRNA MIR100HG和其包含的2個(gè)miRNA，miR-100和miR-125b,對(duì)CRC和頭部頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）細(xì)胞系對(duì)cetuximab耐藥機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)miR-100和miR-125b都能下調(diào)5個(gè)負(fù)調(diào)控Wnt-β-catenin信號(hào)的分子，來促進(jìn)Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的耐cetuximab性能。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MIR100HG的表達(dá)能促進(jìn)miR-125b的表達(dá)，miR-125b的表達(dá)能抑制GATA6的表達(dá)，而GATA6的表達(dá)又能抑制HIR100HG的表達(dá)，而MIR100HG的高表達(dá)與CRC病人的耐cetuxima過程有關(guān)。該研究為治療和診斷結(jié)直腸癌的耐cetuxima提供一定的參考意義。
補(bǔ)充：約有17.5%的miRNA來源于lncRNA,定義為lnc-pri-miRNA，對(duì)這種miRNA的轉(zhuǎn)錄形成機(jī)制感興趣的童鞋可以看這篇文獻(xiàn)(Microprocessor mediates transcriptional termination in genes encoding long noncoding microRNAs)

 這篇文章的主要研究結(jié)果如下
1. 建立了抗cetuximab的腫瘤細(xì)胞
1）作者團(tuán)隊(duì)選用KRAS/NRAS/BRAF基因未突變的微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)直腸癌細(xì)胞，HCA-7，同時(shí)采用3維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來建立抗cetuximab（CTX）的結(jié)直腸癌細(xì)胞團(tuán)（CC-CR）。一個(gè)簡(jiǎn)單抗CTX細(xì)胞系的構(gòu)建就需要4個(gè)月，經(jīng)歷不少于20次2維細(xì)胞培養(yǎng)和3維加藥細(xì)胞培養(yǎng)的循環(huán)，科研果然是寂寞的重復(fù)！
2）成功構(gòu)建CC-CR后作者又通過一系類的驗(yàn)證來確定CC-CR的確是抗CTX。首先通過DIC（微分干涉對(duì)比顯微鏡）對(duì)比CC（對(duì)cetuximab敏感的結(jié)直腸癌細(xì)胞團(tuán)）和CC-CR的形態(tài)差異，發(fā)現(xiàn)CC是中空的排列整齊的單細(xì)胞團(tuán)，而CC-CR是實(shí)質(zhì)紊亂的細(xì)胞團(tuán)。其次是用CTX處理CC和CC-CR觀察其克隆存活數(shù)和增殖、凋亡情況，發(fā)現(xiàn)CC在CTX的存在情況下克隆數(shù)大幅度下降、增殖抑制、凋亡細(xì)胞明顯增多，而CC-CR基本沒有差異。最后在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上檢測(cè)了CC異種移植瘤對(duì)CTX敏感，而CC-CR異種移植瘤無懼CTX依然保持著低分化和增殖特性。做科研就要從保持嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，多方面驗(yàn)證自己的結(jié)論，這樣才會(huì)避免被撤稿危機(jī)。

 

2. 發(fā)現(xiàn)在抗cetuximab細(xì)胞中MIR100HG和來源于這個(gè)lncRNA的兩個(gè)miR-100、miR-15b的表達(dá)上調(diào)
1） 作者是怎樣發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)非編碼RNA-MIR100HG和miR-100、miR-125b在抗cetuximab 結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)的呢？當(dāng)然是我們永諾生物擅長(zhǎng)做的基因測(cè)序！作者將3維培養(yǎng)的CC和CC-CR進(jìn)行全外顯子測(cè)序和RNA-Seq，沒有發(fā)現(xiàn)與已知的抗cetuximab相關(guān)的基因，但是RNA-Seq發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本。利用miRNA-Seq發(fā)現(xiàn)7個(gè)上調(diào)的miRNA和24個(gè)下調(diào)的miRNA。而且差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本中l(wèi)ncRNA MIR100HG是上調(diào)最顯著的，而差異表達(dá)的miRNA中上調(diào)最顯著的是miR100和miR-125b。

 

2） 通過QPCR驗(yàn)證了MIR100HG和miR-100、miR-125b在CC-CR中高表達(dá)，同時(shí)利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了MIT100HG的表達(dá)和miR-100、miR-125b的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)他們的確是有緊密聯(lián)系。作者還利用FISH發(fā)現(xiàn)與CC異種異種移植瘤相比MIR100HG和miR-100、miR-125b在CC-CR異種移植瘤中富集。并分析其他30種CRC細(xì)胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在抗cetuximab CRC細(xì)胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表達(dá)更高。

 

3） 作者還在8種頭部頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）細(xì)胞系中檢測(cè)了MIR100HG和miR-100、miR-125b的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抗cetuximab的NHSCC細(xì)胞系中MIR100HG和miR-100、miR-125b的表達(dá)上調(diào)。

3. MiR-100和miR-125b協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的抗cetuximab
作者通過構(gòu)建miR-100和miR-125b的過表達(dá)和干擾（sponge）慢病毒，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-100、miR-125b以及其sponge的CC、CC-CR細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CC或是干擾CC-CR的miR-100對(duì)的細(xì)胞的抗cetuximab能力沒有miR-125b強(qiáng)。作者從3個(gè)方面進(jìn)行了驗(yàn)證：1）CTX處理miRNA改變后CC和CC-CR檢測(cè)其克隆的形成，2）檢測(cè)增殖和凋亡，3）在裸鼠皮下種植異種瘤檢測(cè)腫瘤大小。3個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示CC過表達(dá)miRNA后其抗cetuximab能力上升，而CC-CR過表達(dá)miRNA的sponge后其抗cetuximab的能力下降。作者同時(shí)還在其他結(jié)直腸癌細(xì)胞系和HNSCC細(xì)胞系中驗(yàn)證了miR-100和miR-125b協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的抗cetuximab作用。

 

 

4. MiR-100和miR-125b通過抑制多個(gè)Wnt負(fù)調(diào)控因子增加Wnt信號(hào)
1） 作者通過分析上面mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在CC-CR里下調(diào)的基因有Wnt信號(hào)通路下調(diào)分子（DDK1和DDK3），而Wnt的活性在CC-CR里是激活的。作者猜想miR-100和miR-125b可能通過Wnt的下調(diào)分子來激活Wnt信號(hào)。利用生物信息學(xué)分析軟件和網(wǎng)站作者發(fā)現(xiàn)DDK1的3’UTRs區(qū)有miR-100的結(jié)合位點(diǎn)，而DDK3的3’UTRs區(qū)有miR-125b的結(jié)合為點(diǎn)。作者還分析了Wnt的其他負(fù)調(diào)控分子ZNRF3、RNF43、APC2有miR-100和miR-125b的結(jié)合位點(diǎn)。然后通過構(gòu)建這5個(gè)負(fù)調(diào)控分子的雙熒光報(bào)告質(zhì)粒，通過雙熒光分析實(shí)驗(yàn)確認(rèn)他們的確有相互作用位點(diǎn)。WB檢測(cè)了CC過表達(dá)miRNA后這5個(gè)分子的表達(dá)下降和CC-CR干擾miRNA后這5個(gè)負(fù)調(diào)控分子的表達(dá)升高。


2） 隨著Wnt負(fù)調(diào)控分子的表達(dá)降低，Wnt分子激活，在CC-CR中酪氨酸磷酸化的p-Y489β-catenin激活增加而且增加了核β-catenin，同時(shí)Wnt靶基因（CCND1、KLF4、MYC、NKD1、PROX1、S100A4）mRNA水平上升。CC過表達(dá)miRNA時(shí)Wnt的靶基因mRNA水平也隨著上升，在其他結(jié)直腸癌細(xì)胞同樣有這樣的現(xiàn)象。
 

3） 用Wnt的負(fù)調(diào)控分子DDK1和DDK3的重組蛋白能恢復(fù)部分CC-CR的cetuximab的敏感性，使CC-CR的增殖降低、凋亡增加。同時(shí)利用Wnt的抑制劑XAV-939和ICG-001也能恢復(fù)CC-CR的cetuximab的敏感性，聯(lián)合使用cetuximab和ICG-001能抑制CC-CR異種移植瘤的生長(zhǎng)。

 
 
綜上述，阻斷Wnt信號(hào)，無論是APC/β-catenin上游還是下游，降解復(fù)合物能恢復(fù)抗cetuximab細(xì)胞的cetuximab的敏感性。
 
5. MIR100HG/miR-125b與GATA6是負(fù)調(diào)控關(guān)系
1）作者通過Match program軟件分析MIR100HG的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子2.5Kb區(qū)域能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，和RNA-seq結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子GATA6既能結(jié)合MIR100HG的啟動(dòng)子區(qū)域又在CC-CR里表達(dá)下調(diào)。CC用cetuximab刺激后GATA6的表達(dá)下降，但是用cetuximab處理48h后GATA6的mRNA水平顯著上升；CC里的GATA6敲除后MIR100HG表達(dá)上調(diào)，而且不再受cetuximab的調(diào)控，說明GATA6能有負(fù)調(diào)控MIR100HG。通過雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MIR100HG啟動(dòng)子活性受GATA6抑制，且程劑量依賴。

2） 作者進(jìn)一步分析了GATA6與MIR100HG啟動(dòng)子結(jié)合的區(qū)域，在MIR100HG啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)了4個(gè)GATA結(jié)合位點(diǎn)，通過逐步截?cái)嗪屯蛔儼l(fā)現(xiàn)了GATA-binding site 2是GATA6抑制MIR100HG轉(zhuǎn)錄活性的主要位點(diǎn)。并通過CHIP和EMSA實(shí)驗(yàn)來證明GATA6和MIR100HG的GATA-binding site 2有結(jié)合。

 

 

3）通過分析發(fā)現(xiàn)GATA6的3’UTR區(qū)域有miR-125b的結(jié)合位點(diǎn)，通過雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)到GATA6的確與miR-125b有結(jié)合。在CC里過表達(dá)miR-125b時(shí)GATA6的表達(dá)下降；而在CC-CR里干擾miR-125b時(shí)GATA6的表達(dá)上調(diào)。作者還在利用TCGA數(shù)據(jù)分析了CRC中GATA6和MIR100HG的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在IV期CRC病人中GATA6是的低表達(dá)而MIR100HG是高表達(dá)。

 

總之，MIR100HG的轉(zhuǎn)錄受轉(zhuǎn)錄因子GATA6的抑制，但是miR-125b的高表達(dá)能抑制GATA6的表達(dá)，而MIT100HG高表達(dá)會(huì)促進(jìn)miR-125b的表達(dá)，這三者之間形成了一個(gè)雙反饋調(diào)節(jié)CC細(xì)胞的抗體cetuximab。

6.  MIR100HG、miR100和miR125b在發(fā)展為抗cetuximab的結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)
作者最后利用臨床數(shù)據(jù)分析了CRC病人在用cetuximab過程中miR-100、miR-125b等研究分子的改變，發(fā)現(xiàn)在cetuximab治療后miR-100、miR-125b和核β-catenin的表達(dá)上調(diào)。GATA6與前期研究結(jié)果相反，在cetuximab治療后同樣是表達(dá)升高，且無論是miR-125b與GATA6還是miR-100與GATA6都沒有負(fù)相關(guān)性。利用FISH檢測(cè)CRC組織里miR-100、miR-125b、MIR100HG、β-catenin、GATA6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與前期研究一致，都是在cetuximab治療后miR-100、miR-125b、MIR100HG、β-catenin的表達(dá)上升，而GATA6的表達(dá)下降。    

 

 

 
作者沒有詳細(xì)解釋為什么出現(xiàn)GATA6與miR-125b的關(guān)系在統(tǒng)計(jì)10例CRC病人經(jīng)過cetuximab治療后表達(dá)沒有成負(fù)相關(guān)結(jié)果。但是作者誠實(shí)的將這個(gè)結(jié)果呈現(xiàn)在文獻(xiàn)里，說明出現(xiàn)相反的結(jié)果可以不用懷疑自己的結(jié)果，可能那就是真實(shí)的結(jié)果，要學(xué)會(huì)接受。
 
最后用一張作者補(bǔ)充數(shù)據(jù)的圖來解釋全部研究分子之間的關(guān)系：作者發(fā)現(xiàn)了非編碼RNA MIR100HG以及其編碼的2個(gè)miRNA參與調(diào)控Wnt信號(hào)通路激活引起的抗cetuximab效應(yīng)。

從這篇文章得到的啟發(fā)：
1. 研究lncRNA時(shí)lncRNA編碼的miRNA也是一個(gè)很好的切入點(diǎn)
2. LncRNA的調(diào)控上游的尋找除了可變剪接，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控涉及的轉(zhuǎn)錄因子也是可以大做文章的
3. 癌癥的抗藥性也是一個(gè)很好的研究點(diǎn)，前提是你有足夠時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。
4. 出現(xiàn)相反結(jié)果要接受，說不定編輯能接受矛盾結(jié)果，不過能合理解釋最好了。
References:
[1] R. L. Siegel, K. D. MillerA. Jemal, Cancer Statistics, 2017, CA Cancer J Clin, 1(67), 7-30, (2017)