Vilber 實用技巧-磷酸化蛋白檢測小妙招

蛋白質(zhì)磷酸化是一種非常重要且廣泛存在于原核生物和真核生物中的翻譯后修飾調(diào)控方式,參與細胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡,細胞骨架調(diào)控、神經(jīng)活動、肌肉收縮、新陳代謝及腫瘤發(fā)生等,對許多生物的細胞功能起著生物“開/關(guān)”作用。
蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸）上的過程，是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制，在細胞信號轉(zhuǎn)導的過程中起重要作用。異常的磷酸化事件常與許多疾病狀態(tài)相關(guān)。

在評估蛋白磷酸化時，可選擇的方法有很多，Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的最常用方法。磷酸化蛋白的檢測具有挑戰(zhàn)性，因此在實驗的各個階段都需要特別注意。Vilber為您提供幾條小妙招，助力您獲得更加滿意的實驗結(jié)果。
 

1.樣品處理：在穩(wěn)定的環(huán)境條件下細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成和分解處于動態(tài)平衡，當在體外從細胞和組織中提取蛋白時，細胞內(nèi)的蛋白酶和磷酸酶就會被釋放出來或被激活，導致目的蛋白分解或去修飾，因此需要在提取物中添加適當?shù)牡鞍酌�、磷酸酶等抑制劑。選用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，并在使用前進行預(yù)冷，是防止樣品處理時蛋白降解和去修飾的有效方法。
2.選擇特異性的磷酸化抗體并檢測總蛋白的量：磷酸化抗體主要是針對磷酸化位點制備的是一種位點特異性的抗體。由于測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，所以需要用非磷酸化的抗體來檢測同源蛋白的總水平，以確定磷酸化組分相對于總組分的比例，并可充當上樣對照。例如：H2O2誘導NIH3T3細胞衰老和AMPK通路抑制。用H2O2處理細胞，在不含H2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5天，可以通過AMPK的磷酸化水平，檢測到AMPK通路的受抑制情況。

Fig. 1 H2O2 induced senescence and AMPK pathway inhibition in NIH3T3 Cells. 

Xiaojuan Han et al., Aging Cell (2016) 15, pp416–427

3.封閉：做好封閉可以降低背景，提高檢測靈敏度。封閉時建議選擇BSA配合TBS緩沖液作為封閉液使用，不建議用脫脂牛奶作為封閉液，因為牛奶中的蛋白質(zhì)可能會干擾磷酸化蛋白的檢測�？墒覝胤忾]2小時或者4℃封閉過夜。封閉時膜與封閉液充分接觸，避免長時間離開封閉液。
4.洗膜：洗膜時要選用合適的洗滌液，選用TBST作為洗滌緩沖液，洗膜四次，每次10分鐘，在脫色搖床上進行，可以很好的去除膜上非特異性的結(jié)合，降低背景。而使用PBS時，緩沖液中的磷酸根，則會產(chǎn)生干擾靶蛋白的磷酸化信號。
 

5.成像：完成了以上所有工作，到了最后檢驗實驗結(jié)果的關(guān)鍵步驟--成像。成像時，底物需要現(xiàn)配現(xiàn)用，配制時更要注意避光及兩種溶液的充分混合，注意實驗的每一個細節(jié)才是實驗立于不敗之地的王道。蛋白的磷酸化水平的變化是一些調(diào)控的主要方式，而這些差異變化往往是很細微的，需要精確的檢測才能準確的闡述這一調(diào)控過程。選擇一個靈敏的檢測設(shè)備，幫您完成最后的檢測工作。

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• - Darq-9深度制冷CCD相機，-90℃，暗電流低至0.0001e/p/s，避免了背景對微弱信號的干擾。即使曝光30min或更長時間，也沒有任何背景噪音干擾；

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• - 多種成像模式，兼容化學發(fā)光和熒光成像，最多可以升級7通道的熒光成像。用戶可以輕松完成磷酸化蛋白等重要的信號轉(zhuǎn)導過程或涉及多個蛋白的復雜調(diào)節(jié)過程；

• - 1000萬的圖像分辨率，在提供高靈敏度的同時，提高圖片的成像質(zhì)量，為您提供高品質(zhì)的成像結(jié)果。

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