默克SMC單分子超高靈敏度檢測平臺在ADA檢測中的應(yīng)用

仇視，博弈，對決，廝殺，像極了武俠小說中的精彩場景，又《邊城將》：“刀含四尺影；劍抱七星文�！�，劍拔弩張，一片刀光劍影。

第一章

抗體藥腥風(fēng)血雨
 

正如我們今天要聊的抗體藥研發(fā)，由大分子藥物，小分子及多肽類藥物，甚至是相關(guān)佐劑都可能直接或者間接引起比較大的免疫原性反應(yīng)，輕者可能項目止步于臨床前期甚至臨床期，對經(jīng)濟投入可謂壓力山大；重者則可能會降低藥物療效，引起過敏反應(yīng)，甚至威脅生命安全。故ADA（Anti-Drug-Antibody）——在PK研究的有效檢測，即系統(tǒng)性、科學(xué)性地完成ADA檢測是PK研究的迫切問題。

近年來經(jīng)常會有各種抗體藥研發(fā)的新聞見諸報端，該市場可謂如火如荼，正值高光時期，從各大單抗藥企的社會責(zé)任來看，正不遺余力解決民生問題，甚感欣慰。

ADA檢測、免疫原性指導(dǎo)

你需要知道這些
 

那我們遵循規(guī)則，來探討一下ADA檢測的特點，繼2009版免疫原性指導(dǎo)原則之后，2016版FDA《免疫原性指導(dǎo)原則（試行）》的發(fā)布給免疫原性分析指明了方向，把兩個相隔7年的制度原則進行比較，即可得到以下幾點特征：

• 2016版指導(dǎo)原則推薦使用基于風(fēng)險的方法來評價免疫反應(yīng)及其帶來的副作用；

• 篩選和確證試驗的方法靈敏度至少達到100ng/mL，遠遠小于之前要求的250-500ng/mL；

• 對確證和滴度試驗做了詳細說明；

• 對方法學(xué)建立和驗證的時間做了更加詳細的說明；

• 增加了關(guān)于糖基化、Fc融合、ADC等內(nèi)容的討論；

• 對于生物類似藥，要用一套標準試驗來真實對比類似藥和原研藥的ADA水平。

綜合幾點，即FDA對免疫原性的評估指導(dǎo)給出了具體要求：

• 高靈敏度

• 高特異性

• 高穩(wěn)定性

• 高親和力

FDA的高要求，我們?nèi)绾螒?yīng)對？
 

結(jié)合以上幾點特征，我們來看看目前通用的檢測方法：

對于抗體研究發(fā)展趨勢，鼠源向人源化—全人抗體—多功能化（雙/多特異性抗體）--小型化（抗體片段/肽段）--精準化（抗體/藥物偶聯(lián)物-ADC），對分析技術(shù)的要求越來越高。

常規(guī)分析技術(shù)一般包括直接或橋接酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECLA）、放射免疫沉淀分析（RIPA）、表面等離子體共振（SPR）等，可采取一種或幾種組合。但由于受限于目前的技術(shù)瓶頸（如ELISA-酶聯(lián)免疫法,ECLA-電化學(xué)發(fā)光法）檢測靈敏度，即檢測背景的受限和反應(yīng)性檢出能力的受限，再結(jié)合ADA的階段性特點，不同時間段的抗體亞型存在差異性的；而且機體在給藥后藥物以及內(nèi)源性分子濃度水平的“干擾”均會影響分析結(jié)果，故抗藥性抗體分析方法應(yīng)準確、靈敏、特異、耐用，能檢測出包括IgG和IgM等所有亞型，同時基于風(fēng)險采用多層次檢測策略評價ADA，按照篩選分析、確證分析、中和分析等進行逐層分析。

第四章

秘籍出世——

默克幫您應(yīng)對ADA檢測的挑戰(zhàn)
 

目前默克生命科學(xué)依托其SMC單分子超高靈敏度檢測平臺，專門開發(fā)了ADA檢測的專用方法學(xué)開發(fā)用檢測試劑盒。

圖1：SMC^TM免疫原性檢測及開發(fā)試劑盒（Cat.No.03-0175-00）

圖2：單分子計數(shù)，精確計數(shù)光子數(shù)量

圖示3：Biotin-drug/AF-drug等摩爾滴定抗兔多抗呈陽性反饋，曲線設(shè)置12個點，CV<20%

圖示4：Biotin-drug/AF-drug等摩爾滴定N/S Ratio，紅色框中ADA在23.44ng/mL濃度下的表現(xiàn)出較好的信噪比和動

圖5：為基質(zhì)耐受檢測，A為運行基質(zhì)濃度為20%，10%，5%，0%的響應(yīng)值，B為信噪比反饋

圖6：對于標曲反饋，20%Matrix（1：5） Biotin-drug0.025µg/mL和AF-drug 0.025µg/mL為最佳的確認結(jié)果

圖7：相較傳統(tǒng)ECL法，SMC檢測靈敏度提高了十倍（從195ng/mL提升到20ng/mL）

*數(shù)據(jù)源于50只藥物誘導(dǎo)獼猴樣本

圖8：數(shù)據(jù)表明沒有證據(jù)證明hook效應(yīng)會影響濃度低于100，000ng/mL的低敏感性范圍

圖9：藥物耐受性檢測：結(jié)果顯示該實驗降低了循環(huán)治療的耐受性，可檢出在0.125µg/mLMAb中約97.7ng/mL的ADA濃度

終章

結(jié)果的精確與否，就在你一念之間
 

SMC的優(yōu)勢到底在哪里？

看看你的結(jié)果，如果和FDA的要求相差甚遠，SMC或許可以幫你找到答案。

SMC技術(shù)相較于當前的ADA檢測金標準提升了至少10倍的檢測靈敏度。

相較當前的方法可降低基質(zhì)耐受并保持一致的藥物耐受性。

極大的降低試劑的消耗成本并可保持穩(wěn)定的檢測動力學(xué)范圍。

當前的數(shù)據(jù)并未做過多的優(yōu)化，用戶仍可通過試劑盒中標配的優(yōu)化buffer進行進一步優(yōu)化以實現(xiàn)更好的性能反饋。

SMC提升ADA檢測靈敏度有助于在免抗疫親和力成熟和ADA類型轉(zhuǎn)換之前檢出ADA濃度。

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