twistDx 的重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)原理

​twistDx 的重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）將徹底改變?cè)谫Y源有限的現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境中擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的能力。

RPA 技術(shù)原理

RPA 體系的重點(diǎn)是重組酶，這些酶與寡核苷酸引物形成復(fù)合體，并使引物與雙鏈 DNA 中的同源序列配對(duì)。單鏈 DNA 結(jié)合（SSB）蛋白與被取代的 DNA 鏈結(jié)合，并使形成的 D 環(huán)保持穩(wěn)定。然后從引物啟動(dòng)由聚合酶介導(dǎo)的 DNA 擴(kuò)增，但前提是存在靶標(biāo)序列。一旦啟動(dòng)，擴(kuò)增反應(yīng)將快速進(jìn)行，因此開(kāi)始時(shí)只需一點(diǎn)靶標(biāo) DNA 拷貝數(shù)，高特異性 DNA 擴(kuò)增在數(shù)分鐘內(nèi)即可達(dá)到可檢出水平。

RPA 循環(huán)
 

RPA 的技術(shù)特點(diǎn)

為什么選擇 RPA 方法?

◇ 速度

RPA 非�？焖伲�在 37～42 °C 這一通常最適宜的反應(yīng)溫度下，只需少量核酸分子即可在 3～10 分鐘（通常）內(nèi)擴(kuò)增至可檢出水平，但這將取決于靶標(biāo)大小。在大部分情況下，只需要一個(gè)人即可在半小時(shí)內(nèi)采集樣本、制備樣本、運(yùn)行檢測(cè)并取得結(jié)果，并且無(wú)需專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)。

◇ 靈敏度

RPA 可檢測(cè)復(fù)合樣本中的單拷貝 DNA 和 10 拷貝甚至更少 RNA，而無(wú)需預(yù)先純化核酸。

◇ 特異性

RPA 具有高度特異性，該技術(shù)可從可能含有數(shù)百納克來(lái)自多個(gè)不同物種的不相關(guān)復(fù)合基因組 DNA（包括人 DNA）的樣本中識(shí)別并擴(kuò)增單個(gè) DNA 分子，抗干擾能力強(qiáng)。

◇ 恒溫運(yùn)行

RPA 在恒定的低溫（37～42 °C 最適宜）下運(yùn)行。對(duì)于某些應(yīng)用，如果需要，即便體溫也可支持 RPA 擴(kuò)增。該反應(yīng)在偏離溫度及低溫設(shè)置下也表現(xiàn)穩(wěn)健，即使在常規(guī)室溫 25 °C 下也將奏效，雖然反應(yīng)速度會(huì)下降; 在此溫度下，只要此生物化學(xué)過(guò)程被正確配置，仍可在一小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果。

◇ 樣本容差

RPA 對(duì)樣本類(lèi)型的要求寬松，有時(shí)可直接檢測(cè)未經(jīng)核酸純化的原始樣本，例如血液、鼻拭子或培養(yǎng)基。通常，只需采用基本的病原體裂解方法處理樣本以釋放核酸即可，例如熱處理或弱堿處理。每種檢測(cè)所需的最合適的樣本制備方法取決于病原體滴定度、是否存在抑制劑以及裂解要求等因素，并將需要設(shè)計(jì)到檢測(cè)程序中。RPA 對(duì)某些復(fù)合樣本類(lèi)型的寬容性使該技術(shù)非常適合廣泛的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地應(yīng)用。

◇ 廣泛的適用性

RPA 能夠方便地應(yīng)用于任何 DNA 或 RNA 靶標(biāo)，無(wú)序列偏好性，這一點(diǎn)對(duì)于 NGS 尤其重要。如果將逆轉(zhuǎn)錄酶添加到反應(yīng)混合液中開(kāi)發(fā)出了超高靈敏度的 RNA 一步檢測(cè)法。

◇ 多重檢測(cè)

通過(guò)將多種引物同時(shí)添加到同一反應(yīng)管中，單次 RPA 測(cè)試即可擴(kuò)增和檢測(cè)多種不同的靶標(biāo)。

◇ 低設(shè)備成本

RPA 僅需要基本的檢測(cè)設(shè)備，也就是說(shuō)，最終用戶(hù)可以使用 RPA 技術(shù)開(kāi)發(fā)出適合各種應(yīng)用和環(huán)境的人性化診斷方法和試劑盒。

◇ 靈活的試劑形態(tài)

核心反應(yīng)組分能夠以穩(wěn)定的干燥形態(tài)供貨，該形態(tài)易于運(yùn)輸，且無(wú)需冷藏即可儲(chǔ)存最多 12 個(gè)月（穩(wěn)定性可能因用途不同而有變化，因此仍建議在冷藏條件下長(zhǎng)期儲(chǔ)存），也能夠以 PCR 試劑更常見(jiàn)的液體形態(tài)供貨，該形態(tài)允許用戶(hù)針對(duì)特定的應(yīng)用改變反應(yīng)體積和組分比例。

◇ 多種檢測(cè)形式

RPA 可應(yīng)用于各種檢測(cè)系統(tǒng)和儀器，包括實(shí)時(shí)熒光探針和夾心法等形式。

RPA 與 其他核酸擴(kuò)增方法 PCR 及 LAMP 的比較

產(chǎn)品系列
 

TwistAmp^? 試劑盒（隨附凍干試劑）的試劑形態(tài)具有高度便利性，非常適合在現(xiàn)場(chǎng)、床邊等環(huán)境中使用，而且特別適用于無(wú)法維持冷鏈的情況下。TwistAmp^? 研究試劑盒包含使用最終用戶(hù)設(shè)計(jì)的特定引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)所需的所有試劑。

包含凍干試劑的 TwistAmp^? 試劑盒具有以下優(yōu)勢(shì)：

* RPA 擴(kuò)增溫度要求低，允許使用低成本、便于攜帶的檢驗(yàn)設(shè)備。

* 干 RPA 試劑足夠穩(wěn)定，可以在室溫下運(yùn)輸。

* 允許多種「適宜現(xiàn)場(chǎng)的」檢測(cè)輸出技術(shù)，例如側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)和熒光技術(shù)。

* RPA 對(duì)一些復(fù)雜樣本類(lèi)型表現(xiàn)出高度穩(wěn)健性（即樣本耐受性），更適合于許多不同的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地應(yīng)用。

除了在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地使用中的優(yōu)勢(shì)，通過(guò) TwistAmp^? 試劑盒還便于為許多應(yīng)用和用途開(kāi)發(fā)出快速、特異且靈敏的 DNA 和 RNA 檢測(cè)方法。

TwistAmp^? Basic 試劑盒可實(shí)現(xiàn) DNA 擴(kuò)增。包含 DNA 擴(kuò)增所需的所有酶和試劑，用戶(hù)只需提供引物和模板。使用 TwistAmp^? Basic 時(shí)，即使 PCR 引物也有效。TwistAmp^? Basic 已被用于固相、加尾引物、配基、電化學(xué)和微陣列等應(yīng)用。

非常適用于：終點(diǎn)凝膠電泳 DNA 檢測(cè)、下游應(yīng)用（例如亞克�。�
 

TwistAmp^? exo 試劑盒可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光 DNA 擴(kuò)增。若想要以均相形式將 TwistDx RPA 擴(kuò)增技術(shù)與 TwistDx 專(zhuān)利熒光 TwistAmp^? exo 探針結(jié)合使用，則推薦使用本產(chǎn)品。用戶(hù)只需提供引物、探針和模板。更多信息請(qǐng)參閱手冊(cè)。

非常適用于：實(shí)時(shí)熒光 DNA 檢測(cè)
 

TwistAmp^? nfo 試劑盒可實(shí)現(xiàn)橫向流動(dòng)檢測(cè)用 DNA 擴(kuò)增。若想要通過(guò)終點(diǎn)夾心法（例如橫向流動(dòng) [LF] 試紙條）檢測(cè)有效 DNA 擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，則適合使用本產(chǎn)品。用戶(hù)只需提供引物、探針和模板。

非常適用于：開(kāi)發(fā)低成本的現(xiàn)場(chǎng)側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)方法。
 

TwistAmp^? Liquid 是為了提供散裝液體形態(tài)的核心 RPA 組分，最終用戶(hù)能夠以不同的比例混合這些組分，以便用戶(hù)為各自的應(yīng)用配制預(yù)混液*。

TwistAmp^? Liquid 具有以下優(yōu)勢(shì)：

最終用戶(hù)可自由調(diào)整預(yù)混液制備量，而不再被局限于凍干試劑的固定體積

最終用戶(hù)可自由調(diào)整反應(yīng)體系中的組分比例，這使 RPA 試驗(yàn)開(kāi)發(fā)工作具有更大的靈活性

TwistAmp^? Liquid Basic 是一款最適合用于凝膠分析或者作固相、加尾引物、適配體、電化學(xué)和微陣列應(yīng)用的 DNA 擴(kuò)增試劑盒。TwistAmp^? Liquid exo 是一款用于以實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的 DNA 擴(kuò)增試劑盒。
 

以靈活的液體形態(tài)實(shí)現(xiàn) DNA 擴(kuò)增。包含 DNA 擴(kuò)增所需的所有酶和試劑，用戶(hù)只需提供引物、dNTP 和模板。更多信息請(qǐng)參閱手冊(cè)。

非常適用于：終點(diǎn)凝膠電泳 DNA 檢測(cè)、下游應(yīng)用（例如亞克隆）、便于使用不同的 RPA 反應(yīng)體積或改變組分比例
 

以靈活的液體形態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 DNA 擴(kuò)增。若想要將 RPA 與 TwistDx 專(zhuān)利熒光 TwistAmp^? exo 探針結(jié)合使用，則推薦使用本產(chǎn)品。除了基本的組分，還包含強(qiáng)大的核酸酶 （核酸外切酶 I），該酶將在擴(kuò)增反應(yīng)期間處理 TwistAmp^? exo 探針并產(chǎn)生實(shí)時(shí)讀出。用戶(hù)只需提供引物、探針、dNTP 和模板。

非常適用于：實(shí)時(shí)熒光 DNA 檢測(cè)，便于使用不同的 RPA 反應(yīng)體積或改變組分比例


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公司背景

TwistDx Inc. 由分子生物學(xué)家兼蛋白生物化學(xué)家 Niall Armes 博士以及 Derek Stemple 博士和 Nagesh Mahanthappa 博士于 1999 年共同創(chuàng)立，其總部位于美國(guó)馬薩諸塞州劍橋市。TwistDx Limited 于 2002 年成立，其公司位于英國(guó)劍橋，2010 年被 IVD 行業(yè) POCT 巨頭美艾利爾 Alere 收購(gòu)，Alere 在 2017 年 4 月被雅培 Abbott 收購(gòu)。

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