鈣離子熒光探針：比值型熒光探針

前面我們介紹了熒光指示劑法可以將Ca2+檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)與其他技術(shù)結(jié)合使用，如可以與流式細(xì)胞儀、熒光分光光度計(jì)、或者熒光顯微鏡進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè) 。紫外光型主要包括Quin-2、Indo-1、Fura-2等，數(shù)量較少，可見光型數(shù)目較多，包括Fluo-3、鈣黃綠素、Rhod-2等。

熒光指示劑根據(jù)測(cè)光原理和數(shù)據(jù)處理的性質(zhì)又可以分為比值型和非比值型兩種類型。其中Fura-2、Benzothiaza、Indo-1和BTC等系列屬于比值型,化學(xué)熒光指示劑大都為非比值型染料。

雖然比值型熒光染料較少，但應(yīng)用廣泛，下面介紹幾種典型的熒光染料的特點(diǎn)：Fura-2 屬于雙波長激發(fā)指示劑，其激發(fā)特性與Ca2+濃度有關(guān)，當(dāng)介質(zhì)中沒有Ca2+時(shí)，其激發(fā)峰為380nm，當(dāng)與鈣結(jié)合時(shí)，激發(fā)峰向短波方向340nm處移動(dòng)，最后分別以340nm、380nm激發(fā),得到發(fā)射光的比例，這種比例與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度成正比例的關(guān)系，這種染料可以減少染料負(fù)載，增強(qiáng)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Fura-2與雙波長顯微熒光分光光度計(jì)聯(lián)用可以測(cè)量單細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，與流式細(xì)胞儀聯(lián)用可以測(cè)定細(xì)胞懸液的Ca2+的濃度 ，與熒光分光光度計(jì)聯(lián)用測(cè)量單細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞懸液鈣離子的濃度，因?yàn)槠浣Y(jié)果準(zhǔn)確，而且不易被漂白，所以是廣泛使用的指示劑。

Indo-1也是一種雙波長發(fā)射指示劑，單波長激發(fā)（340nm）和雙波長發(fā)射（405nm和506nm）,也可以用熒光比率來反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。它的優(yōu)點(diǎn)與Fura-2相似，但其漂白作用明顯，應(yīng)用時(shí)應(yīng)該盡量減小狹縫寬度和盡量減少激發(fā)光照射時(shí)間。 目前最新的熒光指示劑是第三代熒光指示劑Fluo-3,是典型的單波長指示劑，激發(fā)波長位于可見光范圍內(nèi)。最大吸收峰位于506 nm,最大發(fā)射波長是526 nm，F(xiàn)luo-3與Ca2+結(jié)合后其熒光強(qiáng)度比游離時(shí)高出40倍左右，從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾，作為長波長指示劑，F(xiàn)luo-3可以用作激光共聚焦成像研究，或者與其他熒光指示劑

Fura-2和Indo-1的熒光檢測(cè)

在適當(dāng)?shù)臈l件下通過監(jiān)測(cè)比值型熒光指示劑的波長變化與細(xì)胞內(nèi)游離的Ca 2+濃度的變化關(guān)系來檢測(cè)Ca 2+濃度是一項(xiàng)出色的技術(shù)，我們可以通過觀察Fura-2在300 nm至400 nm之間的吸收位移來檢測(cè)鈣離子濃度（同時(shí)以約510 nm的固定發(fā)射波長）。同樣，Indo-1可以被流式細(xì)胞儀的氬離子激光器（〜350 nm）很好地激發(fā)，當(dāng)與細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+結(jié)合時(shí)，Indo-1的發(fā)射波長從〜475 nm轉(zhuǎn)變?yōu)?#12316;400 nm。Fura-2和Indo-1的熒光發(fā)射的一個(gè)關(guān)鍵特征是分別在〜360 nm和〜460 nm處存在一個(gè)等位點(diǎn)（圖1）。此時(shí)，兩個(gè)比值型指示劑的熒光強(qiáng)度均對(duì)游離Ca 2+的濃度不敏感。另外，等位點(diǎn)的存在預(yù)示了正確的實(shí)驗(yàn)室操作，因?yàn)槠渌�離子的污染或錯(cuò)誤的移液會(huì)導(dǎo)致等位點(diǎn)的缺少。

圖1. 在含有0-39μM游離Ca 2+的溶液中，F(xiàn)ura-2的熒光激發(fā)光譜（上）和Indo-1的發(fā)射光譜（下）。

Fura-2和Indo-1衍生物：

AM 酯：比值型指示器的活細(xì)胞加載
Fura-2和Indo-1比值型指示劑可以以AM酯形式用于活細(xì)胞上樣，用AM酯標(biāo)記比值型指示劑有助于其在活細(xì)胞完整細(xì)胞膜上的被動(dòng)擴(kuò)散，一旦進(jìn)入細(xì)胞，非特異性細(xì)胞內(nèi)酯酶就會(huì)水解AM酯，從而激活Ca 2+敏感指示劑。

Fura-2和Indo-1：鹽衍生物

Fura-2和Indo-1也可以作為細(xì)胞不滲透鹽衍生物使用以下方程式確定細(xì)胞質(zhì)中游離Ca 2+的濃度：

[Ca 2+ ] free  = K d [F-F min ] / [F max  -F]

公式中各字母代表：

• K d是指示劑的Ca 2+解離常數(shù)
• F是實(shí)驗(yàn)水平下Ca 2+指示劑的熒光值
• F min是在不存在Ca 2+的情況下觀察到的指示劑的熒光值
• F max是Ca 2+飽和情況下指示劑的熒光值。

與校準(zhǔn)溶液相比，比例指示劑與Ca 2+結(jié)合光譜性質(zhì)在不同細(xì)胞環(huán)境中差異很大。細(xì)胞內(nèi)指示劑的原位校準(zhǔn)產(chǎn)生的K d值通常明顯高于體外測(cè)定的K d值，在離子載體存在下將加載的細(xì)胞暴露于已知濃度的Ca 2+緩沖液中進(jìn)行原位校準(zhǔn)，其中離子載體用于提高細(xì)胞內(nèi)Ca 2+的水平，在K d表1列出了一些鈣比例指標(biāo)的值。

AAT Bioquest開發(fā)了Fura -8TM比值型指示劑，以AM酯和鹽衍生物形式提供，可改善對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的敏感響應(yīng)。與Fura-2相比，F(xiàn)ura-8 TM具有更高的信噪比，同時(shí)保持了對(duì)Ca 2+的相似親和力（圖2）。Fura-8 TM的顯著優(yōu)點(diǎn)是其吸收和發(fā)射波長在紅色光譜方向上移動(dòng)。Fura-8 TM可以在〜365 nm（與Ca 2+結(jié)合）和410 nm（無Ca 2 +）波長下激發(fā)，發(fā)射波長〜525 nm。這樣的光譜特性使Fura-8 TM可通過相對(duì)便宜的大功率LED激發(fā)，并與常見的發(fā)射濾波器組（例如FITC）兼容。此外，F(xiàn)ura-8 TM激發(fā)波長的變化使其可與在360 nm以下激發(fā)時(shí)會(huì)發(fā)出熒光的有機(jī)化合物一起使用，這可能導(dǎo)致錯(cuò)誤信號(hào)。當(dāng)使用Fura-8 TM時(shí), 我們建議使用Ex / Em = 354/530 nm和415/530 nm進(jìn)行比值測(cè)量。圖2.分別用Fura-2，AM（Cat＃21020）和Fura-8 TM，AM（Cat＃21055）測(cè)量的CHO-K1細(xì)胞中的ATP劑量反應(yīng)。將CHO-K1細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/ 100μL/孔在黑壁/透明底部96孔板中過夜接種。將細(xì)胞分別與Fura-2，AM或Fura-8，AM鈣測(cè)定染料上樣溶液孵育1小時(shí)。

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