如何尋找外泌體中可評估m(xù)TBI患者神經(jīng)退行性病變和細(xì)胞毒性的標(biāo)志物

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是全球性的公共衛(wèi)生問題。由于缺乏良好的診斷工具和干預(yù)手段，TBI患者數(shù)量被嚴(yán)重低估，尤其是在體育運(yùn)動(dòng)員和軍人群體中。目前TBI的診斷方式只有昂貴的神經(jīng)影像技術(shù)和腦脊液（CSF）檢測。輕度創(chuàng)傷性腦損傷（mTBI）更是難以診斷，目前還沒有一種可以基于血液診斷的生物標(biāo)志物。因此迫切需要血液中生物標(biāo)志物的開發(fā)，以便在更早和更可治療的時(shí)間點(diǎn)確定大腦的癥狀和神經(jīng)病理學(xué)變化。
 

美國加利福尼亞大學(xué)科研人員的早期工作證明了血漿神經(jīng)源性外泌體（NDE）作為生物標(biāo)志物可用于阿爾茲海默癥（AD）和其他疾病的神經(jīng)退化檢測，然而其作為輕度創(chuàng)傷性腦損傷（mTBI）的診斷標(biāo)志物的研究還很有限。所以該課題組選取了NDE和星形細(xì)胞源性外泌體（ADE）蛋白作為潛在的生物標(biāo)志物來進(jìn)行研究。本研究發(fā)現(xiàn)mTBI患者的NDE蛋白對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元樣受體細(xì)胞具有毒性，而ADE蛋白則沒有。mTBI患者的NDEs中存在神經(jīng)退行性變的標(biāo)志物，并提示這些NDEs可作為鑒別TBI發(fā)病機(jī)制的工具。這一研究成果于2019年10月發(fā)表于Frontiers in Neuroscience（IF=3.6）上。
 

 

研究對象

所有研究對象均為男性現(xiàn)役軍人，平均年齡21.87歲（SD=2.76），詳見表一。
 

 

研究結(jié)果

1.人血漿中的NDEs和ADEs蛋白的富集和分選

首先，研究人員使用結(jié)合有外泌體抗體和FITC復(fù)合物的磁珠來免疫富集人血漿中的NDEs和ADEs（圖1A）。使用CD171（神經(jīng)細(xì)胞粘附分子配體1）來特異性免疫捕獲NDEs；GLAST（谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）用來免疫捕獲ADEs。富集后的復(fù)合物使用流式細(xì)胞儀根據(jù)綠色熒光強(qiáng)度進(jìn)行分類。陽性對照為磁珠-抗體-外泌體-FITC復(fù)合物，陰性對照則為不含外泌體的磁珠-抗體-FITC復(fù)合物（圖1B）。由流式結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組和對照組在FITC+的數(shù)量上沒有明顯差異（圖1C）。針對外泌體標(biāo)志物CD81的ELISA實(shí)驗(yàn)也顯示，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間沒有明顯差異（圖1D）。
 

圖1

2.與對照組相比，mTBI患者血漿的NDEs和ADEs中Aβ42濃度水平較高，而NRGN的濃度水平較低

ELISA結(jié)果顯示，與對照組血漿樣本相比，mTBI組血漿樣本中Aβ42的水平在NDEs和ADEs中都顯著升高（圖2A），NRGN水平（圖2B）則顯著降低。兩組的P-T181-tau水平在NDEs和ADEs中均無顯著差異（圖2C）。兩組的P-S396-tau水平在NDEs中無顯著差異；而在ADEs中，與對照組相比，mTBI組P-S396-tau的水平升高，但無顯著性差異（圖2D）。在兩種來源的外泌體中，與NDEs相比，ADEs的Aβ42（ADE組：1.18 pg/mL；NDE組：0.29 pg/mL）和P-396-tau（ADE組：16.26 pg/mL；NDE組：5.47pg/mL）水平更高，但具體機(jī)制還不清楚。

圖2

用超靈敏單分子免疫陣列分析平臺(tái)（Simoa平臺(tái)）對血漿外泌體的蛋白定量顯示，在NDE組中，mTBI與對照的Aβ40（圖3A）、NFL（圖3B）和T-tau（圖3C）的濃度水平?jīng)]有顯著差異，而在ADE組中，mTBI與對照的Aβ40、T-tau和NFL的濃度水平在Simoa平臺(tái)上非常低，接近檢測不到。

 

圖3

本研究首次報(bào)道了在血漿NDE和ADE蛋白中，Aβ42和NRGN的濃度水平可以區(qū)分mTBI患者（見ROC分析，表3）。

3.實(shí)驗(yàn)組的血漿NDE外泌體蛋白在體外對受者細(xì)胞具有毒性

研究人員還在體外測試了血漿NDE和ADE蛋白在神經(jīng)元樣細(xì)胞中的致病潛能。已有研究表明，NDEs可以在體內(nèi)傳播毒性蛋白，并在體外對受體細(xì)胞產(chǎn)生毒性。該研究首先用NDE或ADE蛋白處理PC12細(xì)胞（PC12細(xì)胞中已預(yù)先加入NGF，即神經(jīng)生長因子進(jìn)行誘導(dǎo)分化），再通過測定乳酸脫氫酶（LDH）在細(xì)胞培養(yǎng)基中的釋放量來評價(jià)外泌體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示經(jīng)mTBI患者血漿NDEs處理過的細(xì)胞顯示出明顯的細(xì)胞毒性跡象，顯微照片清楚展示了樹突氣泡、抑制神經(jīng)突起生長和細(xì)胞死亡等跡象（圖4A）。與對照組（100%存活率）相比，被mTBI患者的NDE蛋白處理過的細(xì)胞，經(jīng)外泌體誘導(dǎo)后細(xì)胞毒性增加約三倍（286.7%）（圖4B，P<0.05）。同樣的，將不同分化的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞用NDE或ADE蛋白處理，同時(shí)用已確診的AD患者的血漿NDE蛋白作為陽性對照�？捎^察到經(jīng)由外泌體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性增加了大約三倍（265.8%），（圖4C，P＜0.05）。有趣的是，ADEs并沒有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性或損害神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞或SH-SY5Y細(xì)胞（圖4C）的膜完整性。
 

圖4
 

本研究發(fā)現(xiàn)血漿NDEs對受體細(xì)胞具有毒性，并首次報(bào)道血漿ADEs對神經(jīng)元樣細(xì)胞無毒。血漿NDEs和AEDs中都含有可檢測的Aβ42和P-tau蛋白，但只有mTBI患者血漿中的NDE蛋白對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元樣細(xì)胞有毒性。一種解釋是神經(jīng)元樣細(xì)胞不容易接受ADEs。另外一種解釋是，與血漿NDE組相比，血漿ADE組中Aβ42和P-tau濃度的降低不足以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
 

小結(jié)

本文在血漿外泌體中蛋白質(zhì)含量的變化，而先前的研究報(bào)道則在血清和/或腦脊液中進(jìn)行。已知外泌體在細(xì)胞間穿梭并運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)和miRNA等物質(zhì)，有助于清除多余或受損的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)及其細(xì)胞內(nèi)溶物。然而目前在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)和功能背后的基本機(jī)制仍然未知，為了提高外泌體在治療和診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值，我們必須更深入地了解這些細(xì)胞過程。
 

將外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白作為潛在的生物標(biāo)志物，在未來可能會(huì)產(chǎn)生重要的臨床應(yīng)用。目前正在進(jìn)行確定這些蛋白質(zhì)在腦損傷后時(shí)間進(jìn)程的研究，并需要闡明這些蛋白質(zhì)是否可預(yù)測長期慢性和/或其他疾病。此外，本研究的研究對象是一個(gè)男性軍人群體，在正常人和女性mTBI群體中的適用性還需進(jìn)一步探索和研究。
 

在過去的2019年，也是外泌體研究熱度持續(xù)升溫的一年，無論是其功能研究還是如何將其用于微創(chuàng)診斷的開發(fā)都有重大的研究進(jìn)展。蛋白作為最終表達(dá)產(chǎn)物，外泌體蛋白研究領(lǐng)域也必將成為外泌體研究不可或缺的部分，Simoa是目前最靈敏的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，飛克級(jí)別的檢測靈敏度可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)Western Blot，ELISA等方法的不足，將極大推動(dòng)外泌體中蛋白成分的研究。SBC目前具有成熟和完備的外泌體分離，鑒定以及Simoa蛋白質(zhì)檢測平臺(tái)，歡迎實(shí)驗(yàn)咨詢。

原文鏈接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnins.2019.01005/full