MiSelect R 在分析稀有免疫細胞免疫治療研究的應(yīng)用

（一） 前言

人類 T 細胞可以靶向腫瘤特異性的突變是癌癥免疫治療的基礎(chǔ)， 如 Keytruda、 Opdivo這類 PD-1 靶向的藥物和 Yervoy 這類 CTLA-4 靶向的藥物，在臨床上都展示出顯著的療效。但目前對這些藥物有效的患者只占所有患者的大約 1/3，臨床都是通過 IHC 檢測腫瘤組織切片，來判斷 PD-1 等靶點的表達量，從而判斷是否適用這些藥物。而獲取腫瘤組織切片是侵入性的，很多情況下無法獲得（某些內(nèi)部器官，如肝、肺等部位的組織采樣成功率很低）；如果腫瘤已被切除，那么后續(xù)就無法重復(fù)取樣，也就無法進行追蹤檢測。 因此， 獲取這些對腫瘤有反應(yīng)性的 T 細胞是一個挑戰(zhàn)。 新的研究發(fā)現(xiàn)從腫瘤患者的外周血里也可以分離得到腫瘤突變特異性的 T 細胞，有助于免疫治療的進一步研究【1】。

臺灣 MiCareo 公司的 MiSelect R“稀有細胞高效獲取分析系統(tǒng)” 是目前一款集稀有細胞（包括“循環(huán)腫瘤細胞 CTCs” 、“稀有免疫細胞”等）富集與鑒定于一體的全自動化設(shè)備，可以從腫瘤患者的外周血里檢測到對腫瘤有反應(yīng)性的稀有免疫細胞，從而評估免疫治療對患者的療效， 并有助于免疫治療的進一步開展。

（二） 免疫治療研究進展

2.1 PD-1+CD8+ T 細胞是攻擊腫瘤細胞的主要族群美國 NIH 的科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)如下結(jié)論，見圖 1-5【2】。
 

圖 1. 對于攻擊腫瘤細胞的 CD8+ TILs 細胞， PD-1+是表達多的族群（32.4%），其次是
TIM-3+（13.0%）、 4-1BB+（10.8%）、 LAG-3+（5.7%）【2】。
 

圖 2. PD-1 和其他 4-1BB、 LAG-3、 TIM-3 受體在 CD8+ TILs 細胞中有共表達性，顯然 PD-
1+是主要的族群【2】。



圖 3. 在新鮮腫瘤組織中， TIM-3+、 LAG-3+、 4-1BB+的細胞，大多數(shù)表現(xiàn)出 PD-1+，如
82.8%的 TIM-3+表達 PD-1、 79.3%的 LAG-3+表達 PD-1、 78.6%的 4-1BB+表達 PD-1，說明
PD-1+仍然是主要的族群【2】。

圖 4. 不管 4-1BB 是陰性還是陽性， 只要 PD-1 陽性， 有 PD-1+的 TILs 細胞在和腫瘤細胞系
共培養(yǎng)時，對腫瘤細胞就有溶菌作用【2】。

圖 5. PD-1 的表達決定了對腫瘤有反應(yīng)的 CD8+ TILs 細胞的數(shù)目：對 PD-1+/4-1BB+的 CD8+TILs 細胞，對腫瘤有反應(yīng)的百分比高，其次是 PD-1+/4-1BB-的 CD8+ TILs 細胞，反應(yīng)比例小的是 PD-1-/4-1BB-的 CD8+ TILs 細胞【2】。

2.2 PD-1+CD8+ T 細胞比例高的人，對免疫治療反應(yīng)較好對非小細胞肺癌患者，用 PD-1 免疫阻斷劑治療時， PD-1+CD8+細胞比例高的人，對免疫治療反應(yīng)較好【3】，見圖 6-7。

圖 6.對于免疫治療有反應(yīng)的患者， PD-1T （高表達） TILs 細胞在所有細胞中的比例和單位面積的數(shù)量均高于沒有反應(yīng)的患者【3】。
 

圖 7. PD-1T （高表達） TILs 細胞＞1%的患者，總體生存率（OS）要高于＜1%的患者【3】。

2.3 液體活檢研究稀有免疫細胞

以往 TILs 的分離僅能從腫瘤組織中獲取，但組織切片的獲取具有很多不便性及侵入性。現(xiàn)在， 與腫瘤組織內(nèi)部的 TILs 細胞一樣，在患者的外周血里也能發(fā)現(xiàn)與 TILs 一致的 PD-1+CD8+的 T 細胞（圖 8）。 腫瘤細胞的刺激使淋巴系統(tǒng)產(chǎn)生大量的功能性免疫細胞，再運送到腫瘤組織周圍，所以在外周血中就可以獲取與 TILs 一致的免疫細胞。 研究外周血循環(huán)中的 CD8+ T 細胞上的 PD-1 表達，為研究腫瘤組織內(nèi)部的抗腫瘤 T 細胞提供了一扇窗戶，也成為進行免疫治療的標志物， 有助于分離出對腫瘤有反應(yīng)的 CD8+ T 細胞，進行免疫治療【1】。

圖 8.外周血循環(huán)中可以分離出新抗原特異性的 PD-1+ T 細胞【1】。

2.4 流式細胞儀很難檢測到外周血中的稀有免疫細胞

圖 9. 在黑色素瘤患者的外周血中，也能發(fā)現(xiàn)新抗原特異性的淋巴細胞。與腫瘤組織內(nèi)部
 

相比，外周血（PBMC）中的 PD-1+CD8+的 T 細胞數(shù)量非常少，流式細胞儀幾乎無法檢測到【4】。

（三） MiSelect R 檢測稀有免疫細胞

3.1 MiSelect R 的高靈敏度

由于 MiSelect R 的創(chuàng)新性設(shè)計， 其對稀有細胞的捕獲和鑒定具有高特異性和高靈敏度， 對于細胞數(shù)很稀少的族群 (<100 cells/mL) ， 流式細胞儀已經(jīng)無法檢測到，而MiSelect R 可以檢測（圖 10）【5】。 因此可以用 MiSelect R 來檢測極微量的外周血中的稀有免疫細胞。
 

圖 10. 對于細胞數(shù)很稀少的族群 (＜100 cells/mL) ， 流式細胞儀已經(jīng)無法檢測到，而MiSelect R 可以檢測到； 而對于＞100 cells/mL 的族群， MiSelect R 檢測到的細胞數(shù)量，幾乎是流式的 2 倍以上，說明 MiSelect R 的靈敏度比流式更高【5】。

3.2 外周血稀有免疫細胞數(shù)量對療效的影響
 

科學(xué)家研究了“肝細胞癌”和“腎細胞癌”的 anti-PD1（Keytruda） 免疫治療， 對 36名“肝細胞癌”患者和 10 名“腎細胞癌”患者， 在免疫治療之前抽取患者的外周血， 用MiSelect R 檢測稀有免疫細胞的數(shù)量。實驗結(jié)果表明： 外周血里稀有 PD-1+CD8+ T 細胞和PD1+CD4+ T 細胞數(shù)目多的患者，其總生存率（OS）和無進展生存率（PFS）均明顯高于此類稀有 T 細胞數(shù)目少的患者（圖 11-13）【5】。
 

圖 11.肝細胞癌患者的外周血稀有 PD-1+CD8+ T 細胞（攻擊性 T 細胞） 數(shù)目與 OS 的關(guān)系【5】。


圖 12.肝細胞癌的外周血稀有 PD-1+CD8+ T 細胞（攻擊性 T 細胞） 數(shù)目與 PFS 的關(guān)系【 5】。



圖 13. 腎細胞癌的外周血稀有 PD-1+CD4+ T 細胞（調(diào)節(jié)性 T 細胞） 數(shù)目與 PFS 的關(guān)系【 5】。

3.3 其他免疫檢查點抑制劑的研究

目前針對免疫檢查點抑制劑的臨床研究的統(tǒng)計結(jié)果如圖 14，可見有部分研究是針對稀有的免疫檢查靶點的，如 TIM-3、 LAG-3、 VISTA、 KIR， 因為 MiSelect R 是通過抗體來標記免疫細胞上的 marker， 所以 MiSelect R 均可有助于此類實驗的開展【6】。
 

圖 14. 免疫檢查點抑制劑的臨床研究的統(tǒng)計結(jié)果【6】。

3.4 MiSelect R 檢測稀有免疫細胞的影像

圖 15. MiSelect R 檢測結(jié)直腸癌患者的稀有免疫細胞的影像，可見可以針對 IFN-r、 TIM-

3、 LAG-3 靶點進行標記【5】。

（四） MiSelect R 介紹

臺灣 MiCareo 公司的 MiSelect R“稀有細胞高效獲取分析系統(tǒng)” 是目前一款集稀有細胞（包括“循環(huán)腫瘤細胞 CTCs” 、“稀有免疫細胞”等）富集與鑒定于一體的全自動化設(shè)備，技術(shù)法寶包括微流控技術(shù)、激光分選、體積過濾和熒光標記成像，既可以對稀有細胞進行計數(shù)、分析和鑒定（生物標志物分析），又可以獲得高捕獲率、高純度、高活性的稀有細胞，供下游研究使用。

MiSelect R 的原理見： 稀有細胞檢測的突破——MiSelect R 助力稀有免疫細胞檢測。

圖 16. Miselect R 稀有細胞高效獲取分析系統(tǒng)，全自動，省時省力。

（五） 總結(jié)

和市面上其他稀有細胞檢測方法不同， MiSelect R 可對稀有細胞進行計數(shù)、分析、鑒定，并獲得活細胞。具有高純度（>60%） 、高捕獲率（98.5%） 、高細胞活性（>99%） 、 高檢測靈敏度、 可重復(fù)性（CV<10%） 、可視性、 廣譜性以及全自動運行（操作簡單，全血上樣，全自動運行，單機集成）等優(yōu)點，可檢測 EpCAM 低表達的腫瘤細胞株，靈敏度是流式細胞儀的 2 倍。可用于 CTCs 研究、癌癥藥物的伴隨診斷、稀有功能性免疫細胞研究，或產(chǎn)前無創(chuàng)檢測，是非常強大的稀有細胞高效獲取分析系統(tǒng)。

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參考文獻：
【1】 Schumacher,T.N.& Scheper,W., A liquid biopsy for cancer immunotherapy,
Nature Medicine, Volume22, No.4, 2016, pp.340-341.
【2】 Gros,G.,et al., PD-1 identifies the patient-specific CD8+ tumor-reactive
repertoire infiltrating human tumors, The Journal of Clinical
Investigation, Volume124, No.5, 2014, pp.2246-2259.
【3】 Thommen,D.S.,et al., A transcriptionally and functionally distinct PD-1+
CD8+ T cell pool with predictive potential in non-small-cell lung cancer
treated with PD-1 blockade, Nature Medicine,
https://doi.org/10.1038/s41591-018-0057-z.
【4】 Gros,A.et.al., Prospective identification of neoantigen-specific
lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients, Nature
Medicine, published online 22 February 2016.
【5】 MiCareo Clinical Project Documents.
【6】 Website: ClinicalTrials.gov