生物建模的黑科技-快捷精準的定制化細胞微環(huán)境制備系統(tǒng)（下）

（一） Alveole PRIMO 的原理

定制細胞模型， 研究微環(huán)境對細胞內(nèi)和細胞間機能的影響是細胞和醫(yī)學研究的重要方
向。 如何制備出具有可控性和重復性的微環(huán)境， 以便更有效的研究活細胞和疾病模型， 一直
以來都是生物學家進行體外細胞研究所面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。

法國 Alveole PRIMO “定制化細胞微環(huán)境制備系統(tǒng)” 是創(chuàng)新性定制細胞模型的工具，
能在微米級別的尺度下， 以具有超高靈活度和再現(xiàn)性的生物工程手段實現(xiàn)體外微環(huán)境的定
制， 同時可對其機械力學和生化特性進行設計微調(diào)。


圖 1. 左圖： 選擇電腦中任意一張圖案， 在 LEONARDO 軟件作用下， 用 PRIMO 進行非接觸式、
無掩模 UV 投射和蝕刻。 PRIMO 模塊和大多數(shù)倒置顯微鏡兼容。 右圖： PRIMO 通過控制 DMD
（Digital Micromirror Device） ， 即 DLP chip 的微型鏡片的開合狀態(tài)， 控制投射在細胞
基質(zhì)上的紫外激光的照射強度、 照射時間和照射區(qū)域， 按照圖案進行靈活蝕刻【1】 。 圖 2. PRIMO 有三種設計方法： （1） 基質(zhì)的表面功能化（Micropatterning） ： 適用于細胞
微環(huán)境研究； （2） 水凝膠的結(jié)構(gòu)化： 適用于 3D 細胞培養(yǎng)； （3） 微制造（Microfabrication）：
適用于制造微流控芯片【1】 。
在上一篇中我們探討了第一種設計， 今天探討第二種和第三種： 水凝膠的結(jié)構(gòu)化（圖 3） 和
微制造（Microfabrication） （圖 4） 。

圖 3. 第二種設計： 水凝膠的結(jié)構(gòu)化。 A 圖表示在氧氣不足的條件下， UV 光照射， 可使水凝
膠固化； B 圖表示水凝膠固化的高度隨 UV 照射強度增加而增加。 我們結(jié)合 UV-圖像照射和氣
體可滲透的微反應器， 可獲得 4 種水凝膠的工程方法： 完全多聚化（total polymerization）、
Z 軸控制的多聚化（ z-controlled polymerization） 、 光剪切（photo-scission） 和修飾
（decoration） 。 單獨應用或結(jié)合應用就可以解決水凝膠工程化問題。 適用于 3D 細胞培養(yǎng)
【1】 。 圖 4. 第三種設計： 微制造（Microfabrication） 。 用 UV 光固化感光樹脂/光刻膠
（photoresist） ， 再用 PDMS（聚二甲硅氧烷） 在固化的 photoresist 上倒模， 形成帶有微
結(jié)構(gòu)的 PDMS 芯片。 適用于制造微流控芯片【1】 。
（二） PRIMO 的主要特點和優(yōu)勢【1】 ：
 無掩模： 非接觸式、 無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm） ， 可靈活控制 UV 的強度、 照
射時間、 區(qū)域；
 自動化： 全自動快速定制， 可針對實驗條件進行快速優(yōu)化；
 高靈活性： 可按照任意圖案去構(gòu)建您的基質(zhì)和/或使其功能化， 不限圖案的大小和復雜
程度， 生成不同的細胞模型；
 多樣性/兼容性： 適用于常規(guī)的細胞培養(yǎng)基質(zhì)， 基質(zhì)可為平面或有微結(jié)構(gòu)， 可硬可軟，
如： 玻璃蓋玻片、 塑料培養(yǎng)皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝膠（PEG 丙
烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂、 基質(zhì)膠） 、 光刻膠， 等；
 常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級和次級抗體， 等；
 高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物鏡） ；
 多層次： 可蝕刻 256 個灰階層次， 粘附不同密度層次的蛋白；
 多種蛋白： 可應用 3 種不同蛋白（根據(jù)實驗需求） ；
 自動對齊： 自動進行檢測和圖案定位， 可自動對齊于微結(jié)構(gòu)或者微圖案上；
 速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡， 僅需 30s。
（三） 應用舉例：
（1） 非粘附性基質(zhì)的細胞球標準化 圖 4. PEG 水凝膠為非粘附性基質(zhì)， 通過光固化和光剪切， 使 UV 敏感的水凝膠形成特定形狀，
再進行功能化。 水凝膠固化會形成微孔（直徑 100um， 高度 175um） ， HEK 細胞種植其中形
成細胞球【2】 。
上圖： 光聚合的 PEG 水凝膠（4-arm-PEG-acryl hydrogel） 槽內(nèi)的 HEK 細胞球。
下左圖， 下右圖： 共聚焦熒光顯微圖像， 雙球體和小球體。
杯狀的 PEG 模板可用于細胞球體培養(yǎng)。 細胞球是細胞的聚集， 可以作為生理模型或復雜類器
官的起始模型。 但以前因為缺少適當?shù)呐囵B(yǎng)基質(zhì)， 所以它的形狀和細胞數(shù)目都不同， 導致實
驗結(jié)果不可靠。 現(xiàn)在我們將 HEK 細胞種植在不同拓撲結(jié)構(gòu)的 PEG 杯中， 可形成標準化的細胞
球， 其體積和形狀和 PEG 微孔一致。 水凝膠的惰性、 透明性、 可滲透性和靈活性結(jié)構(gòu)使其成
4
為細胞球生長的首選材料。
PRIMO 作用： 非粘附性水凝膠基質(zhì)固化形成微孔， HEK 細胞種植其中形成細胞球。
（2） 粘附性基質(zhì)的細胞培養(yǎng) 圖 5. D 圖： 可以粘附細胞的水凝膠波浪形結(jié)構(gòu)， 右側(cè)圖是在水凝膠上生長的 COS-7 細胞的
肌動蛋白細胞骨架， 肌動蛋白被染色。
E 圖： 模擬小腸絨毛結(jié)構(gòu)。 藍色是 4-arm-PEG-hydrogels， 紅色是 Poly-L-lysin（聚-L-賴
氨酸） ； 右側(cè)圖也是在水凝膠上生長的 COS-7 細胞的肌動蛋白細胞骨架， 肌動蛋白被染色。
【2】
PEG 或瓊脂糖水凝膠是生物惰性的： 它們阻止生物分子的吸附和細胞的粘附。 而基質(zhì)膠
（Matrigel） 是一種溫度凝固的水凝膠， 富含層粘連蛋白（laminin） 、 膠原蛋白（collagen）
和其他粘附因子， 是高度細胞相容性的。 通過混合基質(zhì)膠和可以光聚合的 PEG 前體， 可以創(chuàng)
造出粘附性的雜合的水凝膠， 種植的細胞快速均勻一致的鋪展， 在結(jié)構(gòu)的頂部形成融合層（D
圖） 。
PEG 或瓊脂糖水凝膠是生物惰性的， 而光交聯(lián)劑 Acryl-PEG-Sva（APSv） 是一種能對水凝膠
進行修飾的分子。 這種異向雙功能分子可以光交聯(lián)到水凝膠上， 同時 APSv 的其他基團通過
酯化反應交聯(lián)氨基豐富的粘附分子， 如聚-L-賴氨酸。 光交聯(lián)后的混合水凝膠就局部地反轉(zhuǎn)
了初始凝膠的生物惰性， 允許其吸附大范圍的蛋白質(zhì)（E 圖） 。
PRIMO 的作用： 混合惰性水凝膠和其他水凝膠， 形成粘附性基質(zhì)， 或改造惰性水凝膠成為粘
附性基質(zhì)， 再通過光固化和光剪切， 使 UV 敏感的水凝膠形成特定形狀， 表面進行功能化，
再種植細胞。
（3） 用微制造（Microfabrication） 進行微流體結(jié)構(gòu)設計

圖 6.用微制造（Microfabrication） 進行微流體結(jié)構(gòu)設計【3】 。
PRIMO 實驗：
左圖： 用感光樹脂/光刻膠 SU8 制造出直徑為 3um， 間距為 3um 的微柱結(jié)構(gòu)。
中圖： 用感光樹脂/光刻膠 SU8 制造出的微流體結(jié)構(gòu)。
右圖： 微流體結(jié)構(gòu)的外形。
PRIMO 作用： 通過在固化的感光樹脂/光刻膠上倒膜制造出微流體結(jié)構(gòu)。
（四） 總結(jié)
PRIMO 強大的生物建模能力和對細胞微環(huán)境的控制， 可以為多種生物學實驗帶來全新
的、 突破性視角， 可用于研究細胞遷移、 細胞黏附、 細胞趨觸性、 2D/3D 細胞標準化培養(yǎng)、
細胞球培養(yǎng)、 生物力學、 組織工程、 微流體設計等多個領域。
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參考文獻：
【1】 Alveole 的官網(wǎng)： https://www.alveolelab.com/

【2】 Aurélien Pasturel et.al.,Tailoring hydrogels.

3D cell culture templates with common

【3】 Jérémy Decock et.al., In-situ photo-patterning of pressure-resistant hydrogel
membranes with controlled permeabilities in PEGDA microfluidic channels.