雙轉(zhuǎn)盤共聚焦技術(shù)在藥物研發(fā)和細(xì)胞功能學(xué)中的應(yīng)用

1、3D長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察利器：雙轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)為你而來(lái)

由Yokogawa（橫河電機(jī)）推出的雙轉(zhuǎn)盤高內(nèi)涵分析系統(tǒng)CV8000，配備了最新一代微透鏡型雙轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描模塊（CSU-X1），在成像效果、成像速度等方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)得益于優(yōu)秀的整體光路設(shè)計(jì)，系統(tǒng)具有更高的光利用率，在保證成像質(zhì)量和成像速度的前提下，實(shí)現(xiàn)更低的光漂白和光毒性，在藥物篩選研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

圖1. 雙轉(zhuǎn)盤式共聚焦活細(xì)胞成像分析平臺(tái)

其中高內(nèi)涵系統(tǒng)的重點(diǎn)技術(shù)之一在于轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)，目前市場(chǎng)上最常見的轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)是由日本Yokogawa（橫河電機(jī)）公司生產(chǎn)的 CSU系列，主流轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡多使用的是這一系列。
 

圖2. Yokogawa轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)原理示意

CSU-X1雙轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)由兩個(gè)同軸排列的針孔圓盤組成，中間裝有一個(gè)二向色鏡。上方圓盤的針孔中裝有菲涅爾微透鏡 (Microlens disk)，將光線聚焦通過(guò)下方針孔盤（pinhole disk）相對(duì)應(yīng)的針孔。微透鏡盤的使用能夠顯著增加透光量，提高圖像信噪比；同時(shí)進(jìn)一步減小了激光功率，降低光漂白，延長(zhǎng)成像時(shí)間。
 

長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察分析
 

超快速3D成像和分析
 

2、獨(dú)家內(nèi)置移液加樣模塊：高效勝任鈣流反應(yīng)和急性藥物毒性反應(yīng)


另外值得一提的是，CV8000獨(dú)家內(nèi)置移液加樣模塊，分別配置細(xì)胞板、化合物板、tips板位，機(jī)械臂抓取槍頭后吸取化合物置于細(xì)胞板內(nèi)，迅速反應(yīng)后觀察短時(shí)生物學(xué)反應(yīng)，更好的勝任如鈣流反應(yīng)和急性藥物毒性反應(yīng)。
 

圖3. 鈣流反應(yīng)

3、CAR-NK對(duì)類器官選擇揭秘：CV8000完美捕捉靶向殺傷全過(guò)程

目前CAR-T細(xì)胞在血液腫瘤治療取得了不錯(cuò)的結(jié)果。然而，對(duì)于像結(jié)腸直腸癌(CRC)這樣的實(shí)體腫瘤，需要新的模型來(lái)測(cè)試CAR工程細(xì)胞在組織樣環(huán)境中的細(xì)胞毒性。基于此，德國(guó)Georg-Speyer-Haus腫瘤生物和實(shí)驗(yàn)治療研究所的Henner Farin課題組開發(fā)了一個(gè)體外平臺(tái)來(lái)研究CAR-NK92細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌類器官的殺傷作用，借助Yokogawa高內(nèi)涵分析系統(tǒng)進(jìn)行了活細(xì)胞成像及殺傷作用統(tǒng)計(jì)分析。

圖4. 使用活細(xì)胞成像觀測(cè)EPCAM-CAR-NK細(xì)胞對(duì)癌類器官的靶向殺傷作用，觀測(cè)時(shí)長(zhǎng)10H，觀測(cè)結(jié)果表明，CAR-NK細(xì)胞的靶向作用相比親本NK細(xì)胞顯著提高。（綠色：表達(dá)GFP的癌類器官；紫色：NK細(xì)胞）
 

圖5. 使用活細(xì)胞成像觀測(cè)CAR-NK細(xì)胞對(duì)類器官的選擇性，觀測(cè)時(shí)長(zhǎng)10 h，觀測(cè)結(jié)果表明，CAR-NK會(huì)定向靶向癌類器官而對(duì)正常類器官無(wú)明顯影響（綠色：表達(dá)EGFR突變體EGFRvIII的結(jié)直腸癌類器官；紅色：DsRED標(biāo)記的正常類器官；紫色：表達(dá)抗EGFRvIII蛋白的NK細(xì)胞

4、阿爾茲海默病因迄今未明：雙轉(zhuǎn)盤共聚焦助力揭示AD病理生理

2019年3月，日本京都大學(xué)的Minako Hoshi研究團(tuán)隊(duì)在Cell子刊iScience上發(fā)表了關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的新成果。他們發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白球體在興奮性神經(jīng)元的反式高爾基網(wǎng)積累，并首先轉(zhuǎn)移到軸突。抑制蛋白酶體使得淀粉樣蛋白球體在反式高爾基網(wǎng)增加，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到樹突。淀粉樣蛋白球體外泌后，導(dǎo)致臨近NAKα3陽(yáng)性神經(jīng)元降解，隨后，分泌淀粉樣蛋白球體的神經(jīng)元非凋亡性死亡。發(fā)現(xiàn)揭示了淀粉樣蛋白球體表達(dá)水平和蛋白酶體功能的關(guān)聯(lián)，對(duì)揭示AD的病理生理有重要作用。
 

YOKOGAWA的雙轉(zhuǎn)盤共聚焦高內(nèi)涵系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了高通量的共聚焦成像及定量分析統(tǒng)計(jì)，可準(zhǔn)確定量β-淀粉樣蛋白聚集體(ASPD)在興奮神經(jīng)元中的聚集水平（圖6）及ASPD對(duì)鄰近NAKα3神經(jīng)元的殺傷作用（圖7）。
 

圖6. 神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染淀粉樣蛋白前體（APPswe），并經(jīng)蛋白酶體抑制劑MG132處理后，ASPD只在Math2陽(yáng)性的興奮性神經(jīng)元細(xì)胞中積累，而在小清蛋白(PV)和鈣結(jié)合蛋白（calbindin）陽(yáng)性的抑制性神經(jīng)元細(xì)胞中不積累。（MAP-2用來(lái)標(biāo)記神經(jīng)元的樹突和軸突）
 

圖7. ASPD具有神經(jīng)毒性，導(dǎo)致NAKα3陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞死亡

該課題組在2003年于AD患者腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了由30個(gè)β-淀粉樣蛋白（Aβ）聚集體，即ASPD，具有神經(jīng)毒性，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生退行性病變，并發(fā)現(xiàn)Na+-K+-ATPaseα3(NAKα3)是ASPD介導(dǎo)神經(jīng)退行性病變的唯一靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，他們研究了蛋白酶體與ASPD的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抑制蛋白酶體的活性, 顯著增加興奮神經(jīng)元內(nèi)的ASPD水平，并改變ASPD在神經(jīng)元內(nèi)的分布，同時(shí)，分泌的ASPD殺死鄰近的NAKα3陽(yáng)性神經(jīng)元。這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對(duì)AD患者大腦中Aβ聚集體形成和傳遞的理解，為將來(lái)研發(fā)治療AD的藥物開辟了可能。 

5、結(jié)束語(yǔ)

CV8000作為新一代的多功能高內(nèi)涵分析平臺(tái)，配備了獨(dú)家的CSU-X1雙轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描單元。該系統(tǒng)光利用率高，低光漂白、低光毒性，可以對(duì)活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀察；系統(tǒng)物鏡和圖像自動(dòng)對(duì)焦，Z軸多層拍照結(jié)合MIP（Maximum Intensity Projection），可對(duì)非同焦平面的像素成像，結(jié)合成像速度優(yōu)勢(shì)，可快速對(duì)3D類器官快速逐層拍照，在同類產(chǎn)品中是類器官成像的利器。我們期待CV8000不斷助力新藥篩選、藥敏分析、疾病發(fā)生機(jī)制的研究，促進(jìn)科研成果的臨床轉(zhuǎn)化，并在新冠病毒藥物篩選及疫苗研發(fā)中貢獻(xiàn)一臂之力。