雙轉(zhuǎn)盤共聚焦技術(shù)：長時間活細(xì)胞3D動態(tài)觀察和分析利器

單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅識別某一特定抗原表位的抗體，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等眾多優(yōu)點(diǎn)。單克隆抗體技術(shù)的問世經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗、人源化單抗階段，這些工程改造抗體不僅為免疫學(xué)領(lǐng)域帶來了一次革命，而且在生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域得到極廣泛的應(yīng)用。如今在臨床上，單克隆抗體也被廣泛用于腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病的治療。
 

在單抗藥物研發(fā)的早期階段，目前普遍的共識是：抗體是篩出來的！這就要求對整個篩選規(guī)模的通量和自動化有較高的要求，并在合適的方法學(xué)模型下“大浪淘沙”，獲得真正有效的hit！然而，目前單抗藥篩選方法無論是ELISA還是FACS，雖然沿用多年，但都存在種種缺陷和不足：
 

1.整個樣品準(zhǔn)備過程流程復(fù)雜，步驟繁瑣，中間涉及到多次的離心、洗滌、孵育再離心和洗滌孵育的過程，費(fèi)時費(fèi)力。

2.ELISA：具備一定的通量并能實(shí)現(xiàn)自動化，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果基于純化的包被抗原，無法獲得符合真正生理情況下細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)，往往導(dǎo)致假陽性過高，一般只作為初篩。

3. FACS：通量較低，雖有高通量的流式細(xì)胞儀問世，復(fù)雜繁瑣的樣品準(zhǔn)備流程依舊是個短板，無法滿足日益增加的篩選通量需求。此外FACS容易堵塞，需要清洗，維護(hù)麻煩，更無法實(shí)現(xiàn)機(jī)械臂整合后的自動化。

二、mirrorball：一步法，真正的免洗
 

由于ELISA和FACS的種種缺陷，英國著名的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室自動化儀器廠商SPT Labtech為此研發(fā)了新一代的抗體藥物篩選平臺mirrorball，其獨(dú)有的均相混合即讀模式（Mix & Read）是專門為細(xì)胞水平的高通量抗體篩選所設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)時，只需將細(xì)胞（無論是貼壁還是懸�。┗蛭⒅椤⒋郎y的抗體（如雜交瘤上清）以及熒光二抗混合在一起孵育，直接讀板，獲得數(shù)據(jù)，中間不需要任何洗滌的步驟。
 

真正的一步法檢測
 

mirrorball 免洗原理：底讀+雙染

首先，mirrorball的激光只會讀取沉降到微孔板底部的細(xì)胞，從而避免細(xì)胞上方背景熒光二抗的干擾。

僅排除上方的背景信號是不夠的
 

其次，用活細(xì)胞染料如Dio或CFSE標(biāo)記細(xì)胞，加入待測的一抗以及相應(yīng)的紅色熒光二抗如Alexa647，同時能檢測到綠色和紅色信號的細(xì)胞即為陽性結(jié)合，紅和綠的共定位，在儀器中顯示為黃色信號，從而排除背景的熒光二抗。
 

雙陽的共定位細(xì)胞即為陽性孔

三、mirrorball主要應(yīng)用

1. 針對細(xì)胞表面抗原的抗體篩選：這是mirrorball最常見也是最廣泛的應(yīng)用。例如在感興趣靶點(diǎn)的細(xì)胞上，加入待測的一抗如雜交瘤上清、細(xì)胞染料和熒光檢測二抗，中間無需任何洗滌過程，孵育1-2小時后直接讀板檢測，同時有細(xì)胞和熒光二抗共定位信號的孔即為陽性結(jié)合孔。
 

384孔雜交瘤篩選workflow


384孔板結(jié)果，綠色為陽性孔


可導(dǎo)出直觀的hot map
 

2. 多重檢測(multiplex):mirrorball可以在一個孔內(nèi)同時檢測陰性和陽性對照并進(jìn)行多指標(biāo)分析。具體方法為,用藍(lán)色的染料如Hoechst標(biāo)記陰性細(xì)胞，用綠色染料如Dio標(biāo)記陽性對照細(xì)胞，將兩種細(xì)胞混在一起后，在加入待測的抗體以及相應(yīng)的熒光二抗。mirrorball能區(qū)分并準(zhǔn)確定位每個孔內(nèi)的綠色和藍(lán)色細(xì)胞，同時分別統(tǒng)計(jì)綠色和藍(lán)色細(xì)胞上紅色熒光二抗的信號。在這個實(shí)驗(yàn)中，只有綠色陽性細(xì)胞上有紅色抗體信號同時藍(lán)色細(xì)胞上沒有的孔才是真正的陽性孔。這個實(shí)驗(yàn)無論ELISA還是流式都必須做兩次，mirrorball可一步完成，節(jié)省一半的試劑和試劑耗材。

多重檢測protocol

 

3. 微珠檢測：除了細(xì)胞水平的篩選外，mirrorball也可以采用和ELISA類似的方法，將純化的抗原（標(biāo)記biotin）包被在帶SA的微珠上，同樣可進(jìn)行抗體的篩選。相比于ELISA，不但免洗而且所需抗原包被的用量僅為ELISA的1/10，可節(jié)省寶貴的抗原。

mirrorball可檢測微珠上的散射光
 

此外，mirrorball也可以進(jìn)行基于微珠的多重檢測和分析，市場上可以買到不同大小的微珠或者不用顏色的微珠，在同一孔內(nèi)，mirrorball可以準(zhǔn)確定位和區(qū)分這些不同大小和顏色的微珠，并分別檢測上面是否有陽性的抗體結(jié)合。

利用不同的微珠進(jìn)行多重分析
 

4. 競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)：mirrorball上還可以實(shí)現(xiàn)免洗競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)。例如 類似于競爭性ELISA。步驟很簡單，在微珠上包被二抗，然后加入固定量的熒光標(biāo)記一抗和待檢測的一抗，混合在一起，孵育一段時間，讀板獲取分析數(shù)據(jù)，并獲得相應(yīng)的IC50。

競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)protocol及分析結(jié)果
 

5. 全自動，整合機(jī)械臂：mirrorball可整合機(jī)械臂機(jī)和疊板架，一天可輕松完成80塊384孔板的篩選通量，其中樣品準(zhǔn)備的時間小于2小時，實(shí)現(xiàn)真的無人值守式的抗體篩選新模式。

無人值守，高通量篩選


四、結(jié)束語

mirrorball自問世以來，以其簡潔、快速和高效的抗體篩選模式，廣受諾華，羅氏，Genentech，禮來，GSK，藥明康德，睿智化學(xué)，恒瑞，和鉑，岸邁，三生國建，華海藥業(yè)等各大跨國藥企、生物技術(shù)公司和CRO的青睞。mirrorball致力于用更簡單的流程、更少的抗原用量、更低的人力和試劑成本、更高的通量去篩選到更好質(zhì)量的抗體！