Inscopix顯微成像技術(shù)在驗證食物偏好的大腦里處理機制的應(yīng)用

度過物資匱乏的年代，享受生活成了的主流，人類創(chuàng)造出出了極其豐富璀璨的美食文化，并在當(dāng)下得到了最好的發(fā)展。我們有分辨五味的能力，但同一種味道，兩個人分辨出來的感覺是一樣的嗎？答案是否定的。每個人因為各自特有的一些神經(jīng)和生物感知上的細微差別，感知的味道是不完全相同的；并且我們對于食物的喜好的復(fù)雜度似乎是超越味覺的，同樣都是甜的或辣的東西，我們的味覺卻有完全不同、極為豐富的感知。
 
這些對食物選擇的偏好在我們的大腦里有什么樣的處理機制呢? 
 
最近，里斯本Champalimaud研究中心Fernandes等科學(xué)家在《neuron》雜志上發(fā)表了一篇名為“Postingestive Modulation of Food Seeking Depends on Vagus-Mediated Dopamine Neuron Activity”的文章，科研人員使用了由格羅貝爾引進中國授權(quán)代理的inscopix nVoke2.0在體自由動物神經(jīng)元成像設(shè)備對小鼠進行了大量實驗和分析，嘗試解密這個大腦處理機制。
 
科學(xué)家們通過實驗驗證小鼠食用蔗糖的攝食后反饋是否可以導(dǎo)致攝食行為，即是否可以誘導(dǎo)調(diào)控小鼠開啟蔗糖開關(guān)，饑餓的小鼠在經(jīng)過訓(xùn)練學(xué)會了通過按壓開關(guān)如何選擇獲得蔗糖和三氯蔗糖（一種無熱量的甜味劑）溶液（F1A）。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，最初小鼠對兩種溶液的取食次數(shù)相似，但隨著時間推移，對蔗糖的取食次數(shù)逐漸增加，說明蔗糖引起的攝食后反饋會促使小鼠更多的索取蔗糖。為了驗證蔗糖的攝食后反饋不靠口感也足以驅(qū)動取食行為，科學(xué)家將小鼠植入了胃導(dǎo)管以進行蔗糖和三氯蔗糖的長期刺激。利用經(jīng)過訓(xùn)練并隨時剝奪小鼠開啟開關(guān)以進行胃內(nèi)注射食物，同時在口部攝取清水，觀察到開啟頻率增高很多。小鼠控制開關(guān)可以在嘴邊獲得清水，并同時會往胃里注入蔗糖溶液，小鼠會加劇地開啟開關(guān)。與之相反，如果胃里注入的是三氯蔗糖，則開啟頻率沒有升高。在另一組小鼠中，相似的訓(xùn)練但同時控制2個開關(guān)，來選擇往胃里注入蔗糖或三氯蔗糖，小鼠沒有通過味覺感知也自行適應(yīng)出了往胃里注入蔗糖溶液的偏好。說明小鼠能隨機感覺出攝食動作和他們的攝食后結(jié)果的差別。為了驗證這種偏好不是由甜味口感刺激驅(qū)動產(chǎn)生的，研究人員使用Trpm5 敲除小鼠，這種小鼠不能感受甜味。實驗結(jié)果依然是偏好蔗糖而不是三氯蔗糖，證明了這些行為是由于受營養(yǎng)物質(zhì)的取食后反饋誘導(dǎo)而不是甜味感受器的介導(dǎo)。
 
 
接下來，研究人員對蔗糖攝食反饋增強索食行為的主要機制進行了研究。之前已經(jīng)有研究證明飼喂誘導(dǎo)的紋狀體中多巴胺釋放可以不通過味覺感知而被攝食后反饋來驅(qū)動。但是，還沒有證明攝食后反饋對多巴胺能神經(jīng)元活動有直接影響。
 
為了探討腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）多巴胺能神經(jīng)元對攝食后增強索食行為的是否有潛在影響，研究人員在每日偽隨機順序進行蔗糖或三氯蔗糖胃內(nèi)灌注，并在同時對自由活動小鼠的VTA多巴胺能神經(jīng)元活性進行了監(jiān)測。他們使用深部腦區(qū)鈣成像技術(shù)在4只DATIRES: Cre小鼠中測量了VTA多巴胺神經(jīng)元活性（圖2A，2B）。
 
使用inscopix公司的nVista微型顯微成像設(shè)備，可以在小鼠進行攝食行為學(xué)實驗時及其自由活動期間對其大腦內(nèi)的神經(jīng)鈣活動信號進行實時觀察及記錄，整個顯微鏡埋植在小鼠頭骨上，由一根自聚焦透鏡深入腦內(nèi)部，可以對深部腦區(qū)紋狀體甚至最下面的乳頭體進行細致精確的觀察。透鏡有0.5mm、0.6mm、1mm直徑的選擇，整個透鏡重約2克，小鼠完全可以清醒狀態(tài)下進行取食及各種自由行為活動。根據(jù)調(diào)整內(nèi)部液體透鏡的電子對焦，其焦平面變化可變范圍達300微米，借助鈣指示病毒表達的綠色熒光蛋白可以清晰顯示神經(jīng)元胞體、軸突的脈沖式鈣活動，反映神經(jīng)環(huán)路中的具體實時活動。配套的軟件可以自動的對活動神經(jīng)元進行識別統(tǒng)計，集成的算法可視化的對每次活動進行強度和持續(xù)時間的統(tǒng)計。
 
實驗中，平均每只動物每天記錄19個神經(jīng)元的活動。在活動神經(jīng)元數(shù)量上，蔗糖組和三氯蔗糖組沒有顯著差異（圖2C）。但相對于三氯蔗糖，胃內(nèi)輸注蔗糖后，活動上調(diào)的神經(jīng)元比例顯著增加（圖2D），而且這些被蔗糖上調(diào)的神經(jīng)元持續(xù)活動時間相對于基線水平更長（圖S2B），那些活動下調(diào)的神經(jīng)元未發(fā)現(xiàn)活動持續(xù)的差異（圖S2C）。

在對最后一個蔗糖攝入階段和隨后的三氯蔗糖攝入階段記錄的40個神經(jīng)元進行分析時，結(jié)果得到了證實，相對于三氯蔗糖，神經(jīng)元對蔗糖的反應(yīng)明顯更大，與三氯蔗糖相比，蔗糖正調(diào)的神經(jīng)元更多。對最后一個蔗糖攝入階段和前期的三氯蔗糖攝入階段記錄的神經(jīng)元進行分析時，結(jié)果是一致的。在整個實驗過程中，在蔗糖和三氯蔗糖攝入時進行的運動測量顯示沒有差異，表明運動不是兩者VTA多巴胺神經(jīng)活動出現(xiàn)差異的原因。

這些數(shù)據(jù)表明，蔗糖的攝食后效應(yīng)足以在VTA多巴胺能神經(jīng)元中誘導(dǎo)出現(xiàn)持續(xù)的活性。
 
 
為了測試VTA多巴胺能神經(jīng)元活動對于攝食后索食是否必要，研究人員制作了NMDA依賴的條件性控制多巴胺能神經(jīng)元burst活動的小鼠，可誘導(dǎo)其對預(yù)期獎勵刺激和學(xué)習(xí)的活動響應(yīng)降低及神經(jīng)可塑性的改變。

并制作了Th-Cre小鼠來實現(xiàn)標記細胞類型和分布的特異性，該小鼠主要在VTA的表達酪氨酸羥化酶基因的神經(jīng)元中表達Cre重組酶。
 
酪氨酸羥化酶和GFP的雙重免疫染色證實Cre重組主要在VTA的多巴胺能神經(jīng)元中，部分發(fā)生在黑質(zhì)中，在LC中僅是很少量表達。
 
科學(xué)家們正是利用Inscopix nVista，nVoke系例設(shè)備，可以滿足任何形式的大腦神經(jīng)元，神經(jīng)環(huán)路研究，對自由狀態(tài)下的小鼠大腦內(nèi)如煙花般的神經(jīng)脈沖電流進行真實準確的記錄！
 
然后將Th-Cre小鼠與攜帶可剪切NMDA受體NR1亞基的小鼠Grin1-Flox雜交，子代小鼠的TH神經(jīng)元中具有NR1 缺失（KO），我們將其稱為Th-CreNR1KO小鼠。為了驗證這些小鼠中特定類型細胞的NMDAR缺失，我們在新鮮腦切片中進行了whole-cell記錄，測量電刺激誘發(fā)的NMDAR介導(dǎo)興奮性突觸后電流。在Th-CreNR1KO小鼠中，僅在記錄的22個VTA多巴胺能細胞中的1個細胞里檢測到INMDA，而在對照小鼠中，在所有VTA多巴胺能和LC去甲腎上腺素神經(jīng)元中都檢測到了INMDA（圖3C和3D）。與GFP報告基因小鼠的結(jié)果一致，在Th-CreNR1KO小鼠中，在記錄的32個SNc多巴胺能神經(jīng)元中有11個神經(jīng)元檢測到了INMDAs，9個LC去甲腎上腺素神經(jīng)元中有8個檢測到了INMDA，這表明LC大部分NMDAR被保留，SNc部分受到影響，但比VTA范圍要小。

為了評估清醒和自由移動的小鼠中VTA多巴胺神經(jīng)元的burst活動，他們在VTA中植入多電極微線陣列，根據(jù)測量得到的波形，基礎(chǔ)放電速率和對多巴胺D2受體激動劑quinpirole的敏感性反應(yīng)，記錄了被推定為多巴胺能神經(jīng)元的活動（圖3E和3F）。在基線水平時，Th-CreNR1KO小鼠在VTA多巴胺能神經(jīng)元的burst數(shù)量和激發(fā)尖峰均較少，說明小鼠被削弱了對獎勵預(yù)期刺激的反應(yīng)。然后，他們對ThCreNR1KO小鼠進行如上實驗，測定它胃內(nèi)注入蔗糖后增強索食行為的能力是否受損（圖3I）。
 
如同預(yù)期，在對照組中，胃內(nèi)蔗糖比胃內(nèi)三氯蔗糖使小鼠產(chǎn)生更多的啟動開關(guān)行為，而Th-CreNR1KO小鼠對胃內(nèi)蔗糖和三氯蔗糖兩組表現(xiàn)出相似的開關(guān)啟動行為（圖3J）。結(jié)果表明依賴于NMDA的burst和多巴胺能VTA神經(jīng)元的可塑性對于蔗糖攝食后增強開關(guān)啟動行為是必需的。

   
盡管有大量的腦-腸功能軸的證據(jù)，但與攝食后營養(yǎng)關(guān)聯(lián)信號引起多巴胺能神經(jīng)元活動和行為反應(yīng)的機制尚不清楚。有證據(jù)表明迷走神經(jīng)損傷會破壞風(fēng)味——營養(yǎng)調(diào)控，但其在營養(yǎng)調(diào)控中的作用仍存在爭議，并且還有激素影響營養(yǎng)物質(zhì)感應(yīng)的報道。鑒于先前的研究，肝迷走神經(jīng)（HVN）有可能擔(dān)負攝食后營養(yǎng)信息的傳導(dǎo)，我們測試了HVN的切斷是否影響蔗糖對VTA多巴胺能活性和強化索食的效應(yīng)。研究人員在3只DAT-IRES：Cre小鼠的HVN處進行神經(jīng)切斷術(shù)，另3只接受假手術(shù)，進行與前述相同的實驗，用深部腦區(qū)鈣成像觀察測量胃內(nèi)注入蔗糖或三氯蔗糖期間VTA的多巴胺能活性。 HVN神經(jīng)切斷并不影響每只動物每階段記錄的平均神經(jīng)元數(shù)量（圖4A）。如預(yù)期的那樣，實施假手術(shù)小鼠在蔗糖組與三氯蔗糖組相比，蔗糖組的VTA多巴胺能活性顯著增加（圖4B）。 假手術(shù)小鼠中，攝取蔗糖鼠的正調(diào)神經(jīng)元比例也更高（圖4C）。而在迷走神經(jīng)切斷鼠中，蔗糖和三氯蔗糖攝取鼠的VTA多巴胺能活性以及正調(diào)神經(jīng)元的比例沒有差異。跟蹤最后一個三氯蔗糖攝食階段和隨后的蔗糖攝食階段中記錄的每個單獨神經(jīng)元（圖4F，G），確定了在假手術(shù)鼠中，被蔗糖正調(diào)的神經(jīng)元比例相比三氯蔗糖大得多，而在神經(jīng)切斷鼠沒有出現(xiàn)同樣結(jié)果，導(dǎo)致蔗糖正調(diào)的神經(jīng)元在切斷組和假手術(shù)組有顯著不同（57％對32％；圖4H）。對于神經(jīng)切斷組，即使目視檢查單細胞多巴胺能活性表明蔗糖的作用持續(xù)時間更長（圖4G），但直接測量比較這些神經(jīng)元在蔗糖和三氯蔗糖攝食期的活性，卻并沒有顯示出顯著的增強劑作用。但是它揭示了一個顯著的時間——增強劑相互作用，這可能反映了胃內(nèi)蔗糖的不依賴HVN的殘留的效應(yīng)。
 
最后，我們在另一組C57Bl6/J小鼠中執(zhí)行了上述的攝食后行為強化實驗（圖4I），發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)小鼠相比，HVN切除小鼠對攝食后蔗糖的有明顯更少但沒有完全消失的開關(guān)控制行為（圖4J）。
這些結(jié)果證實，通過迷走神經(jīng)肝分支的信號傳導(dǎo)在VTA多巴胺能活性和索食行為的攝食后調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。