RT-qPCR常用的SYBR@Green I雙鏈DNA結(jié)合染料的應用

      隨著新冠病毒肆虐全球，聊病毒是個敏感話題。今天我們就從這個敏感話題著手，好好聊一聊。

 

       病毒是一種個體微小，結(jié)構簡單，只含一種核酸（DNA或RNA）。我們現(xiàn)在提起來就咬牙切齒的的新冠病毒（COVID-19），就是一種RNA病毒。當然除了COVID-19，我們常聽到的其他臭名昭著之輩，如艾滋病病毒、流感病毒、登革熱病毒、煙草花葉病毒、噬菌體等均屬于RNA病毒。這些RNA病毒讓之所以讓我們談虎色變，是因為很多RNA病毒具有非常強的侵略能力，會嚴重影響宿主生命活動。如何精準地檢測到病毒（定性）？如何有效判定出樣本中的病毒含量（定量）？借助分子生物學技術可以精準檢測病原體，其中的一步法RT-qPCR技術可被廣泛用于RNA病毒類型判定、病毒亞型判定、病毒定量及病毒突變體等方面，廣泛用于食品安全、動物疫病、疾病診斷與治療效果評估等臨床與公共衛(wèi)生等領域。

 

       一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA為起始模板的定性和定量分析，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過程與靶標基因的PCR擴增于一管內(nèi)依次進行，利用熒光來監(jiān)控PCR擴增產(chǎn)物的變化，進而判斷RNA初始量的技術即為一步法RT-qPCR技術。RT-qPCR根據(jù)化學發(fā)光原理可以分為兩大類：一類為染料類，包括SYBR@Green I，通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加；一類為探針類，包括TaqMan@探針，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加。

 

 

       染料法：

 

       常用的SYBR@Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應體系中，加入過量SYBR@Green 熒光染料，SYBR@Green熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR@Green染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

 

       作為全球最大的克隆供應商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ One-Step SYBR® Green RT-qPCR kit是基于SYBR Green 染料法的Real Time One-Step RT-PCR反應試劑。試劑盒以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應和定量檢測可在同一反應管內(nèi)完成，簡化操作的同時可有效降低污染的風險。試劑盒包含了性能優(yōu)異的逆轉(zhuǎn)錄酶，以及含有熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的緩沖液成分混合而成的5×預混液。在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用抗體修飾的Taq DNA聚合酶進行Real Time PCR反應，抗體的完全封閉有效避免了聚合酶在熱循環(huán)反應前被激活。另外，經(jīng)優(yōu)化的Buffer體系大大提高了PCR反應的擴增效率和特異性，且檢測靈敏度可達0.1pg總RNA，適用于各類型RNA模板的檢測。

 

       一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒優(yōu)勢：
 

       靈敏度高：可從低至0.1pg的RNA提取物中精確檢測目標RNA。

       特異性強：有效抑制引物二聚體及非特異性擴增的產(chǎn)生。

       擴增效率高：在寬廣的GC含量范圍內(nèi)能維持高擴增效率。

 

       一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒：

 

 

 

       圖3. 使用一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒，對HeLa細胞RNA提取物中GAPDH和Actin水平進行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg，并設無模板對照（NTC組）。 A.GAPDH的擴增曲線（紅色）； B.Actin的擴增曲線（藍色）； C.GAPDH（紅色）和Actin（藍色）擴增片段的熔解曲線。

 

 

       圖2. 一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒（紅色）與Competitor T試劑盒（藍色）產(chǎn)品的性能比較。對HeLa細胞RNA提取物中GAPDH和Actin水平進行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg。 A.HeLa細胞提取物中GAPDH擴增曲線的比較； B.HeLa細胞提取物中Actin擴增曲線的比較。

 

       探針法：

 

       PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。再通過實時監(jiān)測整個PCR進程熒光信號的積累，與標準曲線對比進行定量分析。

 

       作為全球最大的克隆供應商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit是基于探針法的Real Time One-Step RT-PCR反應試劑。試劑盒以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應和定量檢測可在同一反應管內(nèi)完成，簡化操作的同時可有效降低污染的風險。試劑盒包含了性能優(yōu)異的逆轉(zhuǎn)錄酶，以及含有熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的緩沖液成分混合而成的5×預混液。在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用熱啟動Taq DNA聚合酶進行cDNA擴增，在DNA擴增期間，與DNA上的靶點結(jié)合的靶特異性探針被Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，報告基團釋放并發(fā)出熒光。

 

       一步法RT-qPCR探針法定量試劑盒：

 

 

 

       圖1. 一步法RT-qPCR探針法定量試劑盒（紅色）與Competitor P試劑盒（藍色）產(chǎn)品的性能比較。使用BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit，對HeLa細胞RNA提取物中ACTB(A)、GAPDH(B)和B2M(C)水平進行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成6個樣本，總量的范圍為10 ng至0.1 pg。

 

 

       圖2. 使用BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit，對HeLa細胞RNA提取物中ACTB(A)、GAPDH(B)和B2M(C)水平進行單通道和三通道分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg，結(jié)果顯示，單通道和三通道的擴增效率相同。

 

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