α-Gal抗原定量檢測試劑盒（標(biāo)準(zhǔn)方法）說明書

α-Gal抗原定量檢測試劑盒（標(biāo)準(zhǔn)方法）說明書
 
使用目的：
本試劑盒適用于動物源性醫(yī)療器械、動物組織及其衍生物等相關(guān)樣本中α半乳糖基抗原（α-Gal）含量的定量檢測。
 
試劑盒原理：
本試劑盒完全按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 動物源性支架材料殘留α-Gal抗原檢測》中給出的方法，利用特異性抗-Gal抗體的酶聯(lián)免疫競爭法（競爭性ELISA或者ELISA抑制法）。即：在保證抗原抗體反應(yīng)物中特異性抗體過量的前提下，首先標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品及試驗樣品的α-Gal抗原與特異性抗體反應(yīng)（消耗部分抗體）；然后用人工合成的Gal抗原（Gal-BSA）作為固相抗原，通過ELISA方法檢測第一次反應(yīng)后上清液中的剩余抗體；進而可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測物中的α-Gal抗原含量。
 
試劑盒組成:
試劑盒A (2~8℃保存)                    

1	Gal抗原包被板	8孔×12條
2	裂解液	50 ml×1瓶
3	抗體Ⅰ稀釋液	12ml×1瓶
4	酶標(biāo)試劑	12 ml×1瓶
5	濃縮洗滌液	50 ml×1瓶
6	顯色液A液	8 ml×1瓶
7	顯色液B液	8 ml×1瓶
8	終止液	8 ml×1瓶
9	覆板貼膜	3張
10	說明書	1份
11	自封袋	1個

試劑盒B （-20℃保存）
  

1	苯甲基磺酰氟（PMSF）	0.9 ml×1瓶
2	Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品	120μl×1瓶
3	抗體Ⅰ(特異性抗-Gal抗體)	0.6ml×1瓶

 


 
自備材料：
1.      Gal抗原陰/陽性參考品為國家標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì), 須自行到中國食品藥品檢定研究院購買。

1. 2ml或5ml離心管；
2. 移液器及吸頭。

 
樣本要求：
樣品采集后，盡早進行樣本制備并檢測，若不能及時進行檢測，須在-20℃保存并避免反復(fù)凍融。
 
安全性：

1. 避免接觸試劑盒中的顯色液A液、B液以及終止液，一旦接觸需立即用大量水沖洗；
2. 試驗過程中不要吸煙、飲食以及使用化妝品；
3. 不要用嘴吸試劑盒中的任何液體。

 
 
試劑盒的保存和使用注意事項:
1.       試劑盒分A和B兩盒，A盒各組分需要在2~8℃保存，B盒各組分需要在-20℃保存，使用前恢復(fù)到室溫并充分混合均勻；
2.       根據(jù)樣品的量決定所需要的板子條數(shù)，建議樣品做3個復(fù)孔，實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，并密封保存，防止受潮；
3.       未用完的試劑，應(yīng)包裝好，避免不同批號混用，同時避免長期打開蓋子放置；
4.       試劑盒過保質(zhì)期不要使用；
5.       顯色液B液對光敏感，避免長期暴露于陽光下，避免用手接觸，實驗完成后應(yīng)在規(guī)定時間內(nèi)讀取OD值；
6.       裂解液在使用前需要按照裂解液體積1%的量加入苯甲基磺酰氟（以下簡稱PMSF），現(xiàn)用現(xiàn)加，加入PMSF的裂解液要一次用完，不可存留再用；
7.       抗體Ⅰ需要使用抗體Ⅰ稀釋液進行20倍稀釋后使用；
8.       洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水；
9.       加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有孔反應(yīng)時間一樣；
10.   按照說明書標(biāo)示的時間以及順序進行操作。
 
樣品預(yù)處理:
1.  Gal抗原陰/陽性參考品制備：精確稱取一定量的陰性/陽性參考品，置于2ml或5ml無菌離心管內(nèi)，加入裂解液（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），制成樣品濃度為2mg/ml混懸液，在室溫放置3h后，4000r/min、離心10min，取上清液備用。
2.  標(biāo)準(zhǔn)品制備：在陰性參考品樣品中加入裂解液（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），配制成2mg/ml作為陰性基質(zhì)液，在其中加入Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度為 4µg/ml，之后依次用等量陰性基質(zhì)液進行梯度稀釋，合計7個系列濃度。
3.  檢測樣品的制備：精確稱取試驗樣品（2 mg～10 mg）置于2ml或 5 ml無菌離心管內(nèi)，若為固態(tài)塊狀或片狀試驗樣品，則用無菌眼科剪將樣品剪裁成細(xì)小碎塊。加入裂解液到一定濃度（裂解液在使用前需要加入1%PMSF），濃度根據(jù)樣品大致含α-Gal抗原量決定，低溫勻漿2 min～10 min，至樣品全部粉碎，無肉眼可見明顯顆粒，形成均勻組織勻漿。室溫放置3 h至樣品全部裂解，4000r/min離心10min，取上清液備用。
 
樣品與抗體Ⅰ反應(yīng)：
將制備好的樣品與抗體Ⅰ（使用抗體Ⅰ稀釋液將抗體Ⅰ進行20倍稀釋）等體積混合（標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為2 µg/ml，1 µg/ml，0.5 µg/ml，0.25 µg/ml，0.125 µg/ml，0.0625 µg/ml，0.03125 µg/ml；檢測樣品的終濃度減半）后，在37℃輕微震蕩溫育2h，之后轉(zhuǎn)4℃過夜。使用前在14000×g，4℃，離心30min后，取上清使用。
 
試劑盒操作過程（剩余抗體I的檢測）:
1.  配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或純化水20倍稀釋。
2.  加樣：分別在相應(yīng)孔中加入抗體Ⅰ反應(yīng)后的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品上清液各100 µl。
3.  溫育：用封板膜封板后，置37℃震蕩溫育60分鐘。
4.  洗板：小心揭掉封板膜，用排槍或其他移液器吸干樣品，在每孔中注入洗液200 µl，浸泡30 s，棄去板孔中洗液，洗滌5遍，最后一次盡量扣干。
5.  加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100 µl。
6.  溫育：用封板膜封板后，置37℃震蕩溫育30分鐘。
7.  洗板：小心揭掉封板膜，用排槍或其他移液器吸干樣品，在每孔中注入洗液200 µl，浸泡30 s，棄去板孔中洗液，洗滌5遍，最后一次盡量扣干。
8.  顯色：將顯色液A液和顯色液B液等體積混合均勻，每孔加入混合好的顯色液100 µl，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色30分鐘。
9.  測定：取出酶標(biāo)板，迅速在每孔加終止液50 µl，輕輕振蕩混勻后，立即測定結(jié)果。在450 nm波長處測定各孔的OD值。
 
檢測結(jié)果計算與分析:
1.  根據(jù)測定的吸光度值，計算各樣品的抗體I結(jié)合抑制率。
        IR = ｛(M-b)-(T-b)｝/(M-b)×100 %
式中:
IR --抗體I結(jié)合抑制率(Inhibition rate),%；
M  --抗體I/陰性基質(zhì)液反應(yīng)OD值均值（100 %反應(yīng)）；
T  --試驗樣品反應(yīng)(Test sample)OD值均值（剩余抗體I的反應(yīng)）；
b  --裂解液反應(yīng)(blank)OD值均值。
2.  以標(biāo)準(zhǔn)品樣品系列稀釋濃度為橫坐標(biāo)（X），抗體I結(jié)合抑制率（小數(shù)）為縱坐標(biāo)繪制最佳曲線方程，推薦使用對數(shù)方程，或者四參數(shù)方程軟件，獲得四參數(shù)方程，直接把待測樣品的抗體I結(jié)合抑制率代入方程式，計算待測樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（Gal-BSA標(biāo)準(zhǔn)品）的量，再乘以1.82×1014/µg(Gal-BSA)，計算單位質(zhì)量待測樣品的Gal抗原含量。
 
試劑盒性能：
1.  靈敏度：最小的檢測濃度≥標(biāo)準(zhǔn)品的第5個倍比系列稀釋濃度。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為＞0.950。
2.  特異性：Gal抗原陰性生物材料參考品不會檢出Gal抗原，陰性參考品的檢測OD值與裂解液對照孔的反應(yīng)OD值不存在顯著性差異。
3.  重復(fù)性：樣品檢測結(jié)果的變異系數(shù)（CV）≤30%。
4.  檢測回收率：標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的檢測回收率為80%～120%。
 
試劑盒局限性：
樣品前處理是影響最終檢測結(jié)果的重要因素，應(yīng)保證抗原的充分暴露。樣品中基質(zhì)的干擾不可避免，為非線性的。因此，需要盡可能保證標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的組成與待檢測樣品的組成相同或者相近。