不同高靈敏相機在數(shù)字PCR的使用操作區(qū)別

PCR即聚合酶鏈式反應，就是一種將特定的DNA片段放大擴增的分子生物學技術, 可以將微量DNA片段擴增成便于檢測的海量目的基因片段，可將PCR看作是生物體外的特殊DNA復制。

最傳統(tǒng)的“代PCR”采用瓊脂糖電泳的方法對PCR產物進行分析，但該方法操作繁瑣、只適用于定性研究、交叉污染風險大。為了避免上述缺陷，同時滿足對基因的表達水平進行定量分析，1992年誕生了 “第二代PCR”——實時熒光定量PCR。

▲瓊脂糖電泳儀及實驗圖片

實時熒光定量PCR是指在PCR擴增的同時對反應體系中的熒光信號進行實時收集，而在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，最終才可確定目的基因的拷貝數(shù)或基因的表達水平。這種方法檢測靈敏度不夠，無法做到絕對定量，此時“第三代PCR”，數(shù)字PCR應運而生。

▲隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)

數(shù)字PCR是將一個DNA樣品分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，這些反應單元稱為微滴，每個微滴中都會對目標基因進行擴增，擴增結束后對熒光信號進行統(tǒng)計分析。最終能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，從而對起始DNA樣品絕對定量。

該方法在統(tǒng)計分析時,不依賴于標準曲線和參照樣本,可直接檢測目標序列的拷貝數(shù),使得檢測靈敏度,精確性大大提高。因而在極微量DNA樣本檢測、復雜成分中微量檢測、稀有突變檢測等需要高精度定量分析領域具有優(yōu)勢。

▲數(shù)字PCR流程大致分為：樣品制備、目標基因分配、RCR擴增、結果讀出

近幾年生命科學行業(yè)的發(fā)展大家有目共睹，數(shù)字PCR檢測也得到了更廣泛的應用，未來其在臨床也將擁有更大的應用前景。目前已在極微量核酸樣本檢測、基因表達研究、癌癥標志物稀有突變檢測、腫瘤個體化診療、無創(chuàng)產前檢查、轉基因成分鑒定等諸多方面具有廣闊應用。

數(shù)字PCR對熒光信號分析的原理，主要開始前在反應體系中額外加入了特別的熒光物質，使得每輪擴增后特定DNA的實際數(shù)量都能夠通過熒光的強度變化被檢測出來。熒光的有無可以“實時”地反映樣品中是否含有特定DNA；而熒光強度的變化情況則可以幫助對樣品中的特定基因進行“定量”。

目標DNA片段本身是十分微小的，即便是通過大量擴增，所產生的熒光信號依然是十分微弱的，需要通過特別的光學系統(tǒng)進行檢測。而針對這種弱光檢測，數(shù)字PCR儀所配置的相機具有高靈敏度、高信噪比、高量子效率以及好的DSNU、PRNU，成為了決定檢測結果可靠性的核心因素。

超高速大視野的新一代制冷背照式sCMOS相機Kinetix，幀速可達400fps，大靶面10MP/6.5μm，量子效率高達95%，三種讀出模式：HDR、常規(guī)、高速。

▲超高速大視野背照式sCMOS相機—Kinetix

制冷型高靈敏 sCMOS相機pco.edge 26，可提供極低的讀出噪聲和暗電流，大靶面26MP/2.5μm，緊湊的外形設計，量子效率可達72 %。

▲制冷型高靈敏 sCMOS相機——pco.edge 26

非制冷大靶面sCMOS相機pco.panda 26，超高分辨率5120 x 5120，像元尺寸2.5μm，擁有真正電荷級的全局快門，極低的讀出噪聲和暗電流，超緊湊的體積，量子效率可達65 %。

▲非制冷大靶面sCMOS相機——pco.panda 26

緊湊型非制冷sCMOS相機pco.panda4.2系列，前照式、背照式可選， 2048×2048分辨率，像元尺寸6.5μm，幀速40fps，超緊湊的外形設計65×65×65mm，適合短時間曝光的低照度應用，前照式80%QE、2.1e-讀出噪聲；背照式95%QE、1.8e-讀出噪聲。

▲緊湊型非制冷sCMOS相機——pco.panda4.2系列

pco.panda 26及pco.panda4.2系列均為非制冷相機，不僅擁有極高性價比，更是擁有高穩(wěn)定性、功耗低發(fā)熱量小因此暗場噪聲較低，無風扇沒有抖動確保成像品質高，體積緊湊易于集成到PCR系統(tǒng)中。

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