恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)引物探針設(shè)計(jì)問題合集
重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)（由英國公司開發(fā)）。以此為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)。該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
酶促重組等溫?cái)U(kuò)增（Enzymatic Recombinase Amplification，ERA），由蘇州先達(dá)基因科技有限公司獨(dú)立自主開發(fā)，擁有全球自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，在低溫條件下(25-42℃)可對(duì)痕量的靶DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，在最適溫度35-40℃時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間僅需15分鐘，以此達(dá)到核酸快速檢測(cè)的目的。該技術(shù)同樣對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，現(xiàn)已應(yīng)用于研究診斷、公共衛(wèi)生、食品安全、水產(chǎn)畜牧等各個(gè)領(lǐng)域。
RPA和ERA的擴(kuò)增引物可以說是整個(gè)反應(yīng)的關(guān)鍵所在，那么怎樣才能設(shè)計(jì)好其引物呢？
1、RPA引物需要多長？
RPA引物一般在32至35個(gè)核苷酸之間。某些情況可能用到少于30個(gè)核苷酸的引物，但擴(kuò)增過程會(huì)顯著減緩。
ERA 引物需要多長？
為了充分利用 ERA 的檢測(cè)速度和靈敏度，我們建議客戶使用 29-32 個(gè)核苷酸長 度的引物。通常情況下，PCR 引物可用于 ERA 反應(yīng)體系，但這類引物的檢測(cè)速 度和靈敏度可能不及較長的引物。
2、RPA引物應(yīng)當(dāng)相距多遠(yuǎn)？
這取決于你的具體應(yīng)用。標(biāo)準(zhǔn)試劑盒適用于不超過500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是沒有下限的，不過RPA引物一般需要擴(kuò)增子超過80bp。擴(kuò)增產(chǎn)物在100-200bp之間，可以實(shí)現(xiàn)最快的RPA擴(kuò)增。
ERA 引物應(yīng)當(dāng)相距多遠(yuǎn)？
一般而言，我們建議兩個(gè) ERA 引物產(chǎn)生的擴(kuò)增片段不應(yīng)超過 300bp。ERA擴(kuò)增片段的大小或許沒有下限，不過根據(jù) ERA 引物最小長度，擴(kuò)增片段的大小最小 約 80bp。為了獲得最快的檢測(cè)速度，最終的擴(kuò)增片段長度應(yīng)為 100-200bp。
3、RPA 我需要篩選多少引物？
這取決于你對(duì)檢測(cè)靈敏度的要求。舉例來說，如果目標(biāo)分子上千，那么絕大多數(shù)引物都?jí)蛴昧�。�?duì)靈敏度要求很高的話，最好是進(jìn)行系統(tǒng)性的引物篩選。一開始篩選的時(shí)候，候選引物可以有10到20對(duì)。測(cè)試的引物越多，找到好引物的幾率也就越大。
ERA 我需要篩選多少引物？
這取決于您對(duì)檢測(cè)靈敏度的要求。舉例來說，如果您只需要每個(gè)反應(yīng)檢測(cè) 1000 個(gè)分子或以上，那么大多數(shù)引物對(duì)都?jí)蛴昧�。�?duì)于極高靈敏度的檢測(cè)，最好是進(jìn) 行系統(tǒng)性的引物篩選以找到好的 ERA 引物。最初篩選時(shí)，測(cè)試的引物條數(shù)通常 是正反向引物各 7 條。測(cè)試的引物越多，找到能夠檢測(cè)單個(gè)分子的好引物對(duì)的幾率就越大。
熒光型ERA產(chǎn)品探針設(shè)計(jì)
- 探針長度為 46-52 個(gè)核甘酸，其中至少 30 個(gè)位于 THF 位點(diǎn)的 5’端，另外至少 15 個(gè)位于其 3’端。
- 熒光團(tuán)與淬滅團(tuán)只能標(biāo)記在胸腺嘧啶（T）上，且熒光團(tuán)與淬滅團(tuán)間距在2-5個(gè)堿基。
- THF為替換位于熒光團(tuán)與淬滅團(tuán)之間的某堿基，且dT-熒光團(tuán)或 dT-淬滅團(tuán)與 THF 之間的核苷酸數(shù)量可以是 0、1 或 2。
- 探針的3’端需加上阻斷基團(tuán)
試紙型ERA產(chǎn)品探針設(shè)計(jì)
- 探針長度為 46-52 個(gè)核甘酸，其中至少 30 個(gè)位于THF位點(diǎn)的 5’端，另外至少15個(gè)位于其 3’端。
- THF為替換位于熒光團(tuán)下游30bp后與阻斷基團(tuán)上游15bp之間的某堿基
- 熒光團(tuán)只能標(biāo)記在胸腺嘧啶（T）上。
- 探針的3’端需加上阻斷基團(tuán)
反應(yīng)需要用多少引物？
基礎(chǔ)反應(yīng)每次需要480nM引物，有時(shí)，稍微改動(dòng)一下引物的用量可以提高其性能。對(duì)不同引物濃度進(jìn)行測(cè)試（從200nM 到600nM）將有助于找到最合適的引物濃度。
反應(yīng)需要用多少探針？
反應(yīng)一般每次需要120nM探針。不過，略微改變探針的濃度有時(shí)會(huì)促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。我們可以在一定濃度范圍內(nèi)（從50nM到150nM），根據(jù)自己的具體應(yīng)用對(duì)探針進(jìn)行優(yōu)化。
現(xiàn)成的PCR引物能用嗎？
RPA多半不行。絕大多數(shù)PCR引物不能用于RPA。
而通常情況下，PCR 引物可用于 ERA 反應(yīng)體系，但這類引物的檢測(cè)速度和靈敏度可能不及較長的引物。
現(xiàn)成的PCR探針能用嗎？
不能。絕大多數(shù)常用的PCR探針并不適合RPA或者ERA反應(yīng)。特別是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探針系統(tǒng)，這樣的酶活性完全不兼容。
篩選引物的時(shí)候必須用探針么？
不一定。任何檢測(cè)方法都可以用來評(píng)估候選引物的性能。不過對(duì)于篩選高靈敏度引物來說，用檢測(cè)探針對(duì)擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控被證明是最快也最省力的方法。
引物篩選時(shí)應(yīng)該用什么樣的條件？
引物篩選的條件最好盡量模擬實(shí)際檢測(cè)時(shí)的條件，例如模板的拷貝數(shù)、樣本純度等等。
給定引物的性能還能再提高么？
一般來說，稍微改動(dòng)一下引物的序列可以提高其性能。任何給定的引物都可以通過以下方法進(jìn)行優(yōu)化：以單核苷酸為基礎(chǔ)略微改變引物的長度；或者保持引物長度不變，以1bp為基礎(chǔ)移動(dòng)引物的位置。經(jīng)過了改動(dòng)的引物，需要重新進(jìn)行擴(kuò)增活性的測(cè)試。
RPA引物的熔解溫度應(yīng)該是多少？
RPA和ERA反應(yīng)是在常溫下進(jìn)行的，DNA的解鏈與PCR有很大不同。傳統(tǒng)估算的熔點(diǎn)不適用于這個(gè)系統(tǒng)。
引物需要特別純化么？
在進(jìn)行引物篩選的時(shí)候，一般不需要純化。在其他情況下，引物的質(zhì)量會(huì)造成批次間的差異。如果對(duì)一致性要求比較嚴(yán)格，最好先純化引物再進(jìn)行RPA或者ERA反應(yīng)。
使用引物和探針的時(shí)候還需要注意些什么？
引物和探針需要同時(shí)添加到體系中，一先一后會(huì)使片段重組出現(xiàn)偏向性。
我該如何選擇探針？
如果使用適用于探針的其中一種試劑盒，需要注意的是，在標(biāo)靶區(qū)域選擇探針位置時(shí)，有一些序列限制。如果存在不合理的限制，本公司可幫助您設(shè)計(jì)備選檢測(cè) 方案。
我如何配制凍干引物、探針？
通常，用 TE（10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA）來制備 100μM 的儲(chǔ)存溶液， 并長期儲(chǔ)存于-20℃。
