中檢院CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)控文件《考慮要點》深度解析

2018年6月5日，中國食品藥品檢定研究院發(fā)布了《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測研究及非臨床研究考慮要點》（以下簡稱《考慮要點》）。相信這一文件對所有CAR-T細(xì)胞治療的從業(yè)者都具有重要的指導(dǎo)意義。
《考慮要點》對CAR-T細(xì)胞研發(fā)和制備的以下幾個方面進(jìn)行了深入的探討：
    -原材料和輔料及其質(zhì)量控制
    -病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體制備及質(zhì)量控制
    -建立可提供T細(xì)胞的供體資質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)
    -CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)、質(zhì)量控制研究及檢測

在“CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)、質(zhì)量控制研究及檢測”這一章節(jié)中，細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞存活率被列為CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量控制的兩項重要的檢測指標(biāo)：

“細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞存活率：對于CAR-T細(xì)胞來說，患者輸入的細(xì)胞數(shù)及活率不僅與臨床有效性及臨床副反應(yīng)密切相關(guān)，而且是設(shè)置CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品包裝規(guī)格及臨床劑量的重要參數(shù)，因此，需要建立準(zhǔn)確的細(xì)胞計數(shù)及活率檢測方法，并建立產(chǎn)品的放行標(biāo)準(zhǔn)。

目前有多種方法用于CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的細(xì)胞計數(shù)，包括傳統(tǒng)血球計數(shù)板計數(shù)法及細(xì)胞自動計數(shù)儀計數(shù)法，其中自動計數(shù)儀又包括不同的計數(shù)原理，如利用臺盼藍(lán)染色計數(shù)、熒光染色法計數(shù)及非染色法計數(shù)等。與人工計數(shù)法相比，自動計數(shù)儀節(jié)省人工，且明顯減少不同操作者之間的誤差，對于產(chǎn)品質(zhì)控檢測來說，自動計數(shù)儀檢測結(jié)果的可重復(fù)性更好。"

我們看到經(jīng)過細(xì)胞計數(shù)儀開發(fā)者多年的市場推廣和用戶自身經(jīng)驗的積累和傳播，自動細(xì)胞計數(shù)儀相對于人工計數(shù)法的優(yōu)勢已被細(xì)胞研究者們廣泛接受以及得到了權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。

《考慮要點》同時提到：“不同自動計數(shù)儀因每種方法計數(shù)原理不同，同一樣本在不同的計數(shù)儀上的結(jié)果會有明顯的差異，這些差異可能來自于染料的特性及其標(biāo)記特性、區(qū)分細(xì)胞不同活力狀態(tài)（如活細(xì)胞、死亡、凋亡細(xì)胞）的能力及計數(shù)軟件的設(shè)計等，因此，應(yīng)在計數(shù)方法驗證的基礎(chǔ)上建立細(xì)胞數(shù)及活率標(biāo)準(zhǔn)，且細(xì)胞數(shù)應(yīng)設(shè)立上限及下限標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞使用前活率應(yīng)不低于70%...” 由此可見，在CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)和質(zhì)控流程中，對細(xì)胞計數(shù)儀的選擇也是相當(dāng)重要的。目前各品牌細(xì)胞計數(shù)儀的計數(shù)原理主要分為兩種：臺盼藍(lán)染色計數(shù)和熒光染色計數(shù)。眾所周知，在CAR-T細(xì)胞制備的前期需要從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中分選出T細(xì)胞，因此PBMC的數(shù)量和存活率對于CAR-T的生產(chǎn)至關(guān)重要。現(xiàn)在小編就以分析PBMC為例介紹一下臺盼藍(lán)染色和以AO/PI（吖啶橙/碘化丙叮）為代表的熒光核酸染色的差異【1】：
以上列出的差異都是從大量實際操作中總結(jié)出來的。用臺盼藍(lán)數(shù)PBMC, 細(xì)胞總數(shù)往往會高于實際白細(xì)胞數(shù)，有時甚至可以達(dá)到10倍以上【2】！另外，由于臺盼藍(lán)容易低估死細(xì)胞數(shù)，用這種方法測出的存活率也會比實際值高，在某些情況下甚至?xí)�高�?0%以上！如果我們用這樣的檢測結(jié)果去進(jìn)行CAR-T細(xì)胞的制備，其后果可想而知。

熒光核酸染色是目前公認(rèn)的最可靠的細(xì)胞計數(shù)方法之一

十多年前，斯坦福大學(xué)的Leonore A. Herzenberg實驗室用AO和EB的混合液對細(xì)胞染色，然后在熒光顯微鏡下計數(shù)，發(fā)現(xiàn)了該方法相對于臺盼藍(lán)法的優(yōu)越之處，尤其是數(shù)混雜的細(xì)胞樣本比如PBMC。 之后，美國Nexcelom公司在此基礎(chǔ)之上于2008年開發(fā)出了AO/PI混合染料，并將熒光計數(shù)功能添加到了Cellometer細(xì)胞計數(shù)儀，使很多實驗室能夠輕松地用這種更精確的方法分析細(xì)胞。2013年，Cellometer的用戶之一國立衛(wèi)生研究院疫苗研究中心的Roederer實驗室將雙熒光染色法分析T細(xì)胞的方法發(fā)表在了Nature Protocols【3】上，使得這一方法為更多科學(xué)家所知。

如今，AO/PI染色法和Cellometer熒光細(xì)胞計數(shù)儀正在被越來越多的研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)用于CAR-T細(xì)胞的研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)控。我們的用戶包括了世界最頂尖的制藥公司、大學(xué)、研究所和生物技術(shù)企業(yè)。我們相信，國家對CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量的控制和管理會越來越規(guī)范和嚴(yán)格，這也意味著在CAR-T細(xì)胞開發(fā)的每一個環(huán)節(jié)我們都需要有工匠精神，精益求精。Nexcelom會一如既往地致力于細(xì)胞分析方法的創(chuàng)新和開發(fā)，為推進(jìn)中國的細(xì)胞治療產(chǎn)業(yè)化貢獻(xiàn)應(yīng)有的力量 
 
文獻(xiàn)索引
1.  Chan L L, Kuksin D, Laverty D J, et al. Morphological observation and analysis using automated image cytometry for the comparison of trypan blue and fluorescence-based viability detection method.[J]. Cytotechnology, 2015, 67(3):461-73.
2.  Chan L L, Laverty D J, Smith T, et al. Accurate measurement of peripheral blood mononuclear cell concentration using image cytometry to eliminate RBC-induced counting error[J]. Journal of Immunological Methods, 2013, 388(1-2):25-32.
3.  Lugli E, Gattinoni L, Roberto A, et al. Identification, isolation and in vitro expansion of human and nonhuman primate T stem cell memory cells.[J]. Nature Protocols, 2013, 8(1):33-42.