基于微流體的單細胞打印系統(tǒng)提高細胞系開發(fā)效率
細胞系開發(fā)和單克隆性的保證是生產(chǎn)生物藥物分子（例如單克隆抗體）過程的關(guān)鍵步驟。該過程開始于將編碼目的蛋白的基因遞送至靶細胞。在分離出能穩(wěn)定表達目的蛋白的單個活細胞之后便可建立細胞系。該過程中的一個重要里程碑是記錄克隆性證明，以確保細胞系的遺傳可復(fù)制性。隨后的步驟包括對克隆進行表征以提高生產(chǎn)力（效價），質(zhì)量和穩(wěn)定性（圖1）。當前細胞系開發(fā)中的工作流程具有許多限制，包括細胞活力低，單細胞分離效率低和克隆性證據(jù)有限。有限稀釋的傳統(tǒng)分離單個細胞的方法僅依賴于統(tǒng)計概率，并且沒有可見的單克隆證據(jù)，該技術(shù)因其單細胞沉積效率低而導(dǎo)致每個板的篩選候選細胞很少。
圖1.上游細胞系開發(fā)中的典型工作流程
Cytena單細胞打印系統(tǒng)（x.sight）是一種創(chuàng)新的噴墨式“打印”分選細胞的設(shè)備，用于從液體樣品中溫和而精確地分離單個細胞。X.sight使用一次性無菌的微流體芯片精確地分離單個細胞，同時在打印不同類型的細胞時也使交叉污染最小化了。
此文展示了使用單細胞打印機和有限稀釋在單細胞沉積效率以及克隆恢復(fù)率的比較。
材料與方法
用于單細胞打印或有限稀釋的細胞制備
對于單細胞打印和有限稀釋，均使用CHO-K1細胞（ATCC），使用的其他細胞系，包括HEK和L929，均以類似方式制備。為了準備單細胞打印，將細胞重懸于PBS中，密度為1 x 10 6細胞/ mL。為了消除細胞團塊，在將樣品裝入打印機芯片之前，通過40 µm過濾器過濾細胞。
通過Cytena單細胞打印系統(tǒng)進行單細胞分選
x.sight可從液體樣品中溫和而精確地分離單個活細胞，該系統(tǒng)使用一次性芯片，可在打印不同類型的細胞時減少了交叉污染。每個芯片可用于一次打印多個96孔或384孔微孔板。為了沉積單個細胞，x.sight通過壓電驅(qū)動的致動器以可預(yù)測的順序產(chǎn)生微液滴（圖2A）。高分辨率相機連續(xù)拍攝芯片噴嘴處的圖像，而成像算法分析噴嘴末端的圖像以檢測單個細胞的存在。當識別到不包含細胞或包含多個細胞的液滴時，真空系統(tǒng)將啟動閥門，從而使這些液滴被虹吸掉。通過算法識別出單個細胞后，將觸發(fā)氣動系統(tǒng)以關(guān)閉真空閥門，從而使包裹單個細胞的液滴在打印機頭移至下一個孔之前掉入下面的孔中。
單細胞來源的克隆性證據(jù)
使用高分辨率相機在噴嘴處對一次性打印芯片成像，以確保細胞出現(xiàn)在聚焦處。當檢測到包含單個細胞的液滴時，將捕獲5個圖像以跟蹤該單細胞下降到噴嘴末端時的狀態(tài)（圖2B）。在液滴形成之前捕獲圖像1-3，在圖像4上，軟件識別確認檢測區(qū)域ROI中的單細胞事件，圖像5顯示液滴噴射之后的噴嘴。注意，基于噴嘴的圖像證據(jù)與在微孔板表面獲得的圖像證據(jù)是互補且具有一致性的。觀察到噴嘴和微孔板圖像之間的高度相關(guān)性為98.9％±1.8（n = 282孔）（數(shù)據(jù)未顯示）。
結(jié)果
Cytena單細胞打印系統(tǒng)和有限稀釋的單細胞沉積效率對比
為了評估使用x.sight的單細胞打印效率，分析了芯片噴嘴的圖像，以確保在將液滴噴射到孔中之前觀察到真正的單細胞事件。根據(jù)儀器噴嘴成像的分析結(jié)果，使用x.sight獲得的單細胞打印總效率為88.5％±5.5（n = 9個微孔板）。兩/多細胞孔和無細胞孔的發(fā)生頻率要低得多（分別為6.7％和4.8％）。每個96孔微孔板的平均打印時間為8.1±2.8分鐘。一張圖片說明顯示，x.sight打印至96孔微孔板的典型結(jié)果為85孔包含1個細胞，6孔包含> 1個細胞和5孔不包含細胞（圖3A）。相比之下，理論接種密度為0.5個細胞/孔的有限稀釋液可實現(xiàn)30％的單細胞孔（28個），10％的多細胞孔（10個）和60％的空孔(58個）（圖3B）。圖3c顯示了單細胞打印和有限稀釋的空孔、單細胞孔和多細胞孔效率的直接比較。與有限稀釋相比，x.sight的單細胞沉積效率提高了約3倍，從而增加了用于下游分析的潛在克隆數(shù)。 
圖3. x.sight與有限稀釋的單細胞沉積效率對比
克隆恢復(fù)率
隨后測試了單細胞打印產(chǎn)生的克隆的生存能力，并將它們與有限稀釋產(chǎn)生的克隆進行了比較。為了量化生存力，將來自有限稀釋或單細胞打印的微孔板定期在成像設(shè)備上成像10天，直到形成明顯的細胞團。圖4A顯示了x.sight的第10天代表性板塊中，包含大量單克隆孔（總共70孔）。圖4B中顯示了有限稀釋的第10天板，其中包含27個單克隆孔。
將來自x.sight和有限稀釋的每孔的克隆團進行計數(shù)，并分類為以下三類之一：空孔，單克隆孔和多克隆孔。觀察到有63.0％±6.5的孔包含單細胞打印產(chǎn)生的單克隆孔（其中1.5％±1.4包含多個克隆，而35.5％±7.3則不含克�。�。同時，觀察到有限稀釋的結(jié)果是26.2％±2.3的孔包含單個克�。ㄆ渲�66.4％±3.9不含克隆，而7.4％±1.9包含多個克�。�。圖4C繪制了來自x.sight和有限稀釋的每塊板的原始單細胞克隆。為了直接測量單細胞活力，在第0天捕獲了熒光標記的細胞，使其生長10天。對于給定的板，通過將單克隆孔的數(shù)目（單細胞孔長起來的）除以單細胞孔的數(shù)目來獲得生存力百分比。x.sight的平均生存力為84％，而極限稀釋度則為81％。同樣，比較了來自x.sight的單細胞來源克隆對不同細胞類型的生存力（圖4E）。通常，使用CHO，HEK和其他常見細胞系時，觀察到的典型生存力大于75％。重要的是要注意，細胞活力會根據(jù)細胞類型，樣品制備，設(shè)定參數(shù)，細胞培養(yǎng)基和其他外部因素而變化。
圖4.單細胞打印機和有限稀釋的存活率對比
（A）顯示了來自單細胞打印的第10天細胞團（綠色）。70個孔包含單個克隆團，1個孔包含2個克隆團，25個孔不包含克隆團。（B）有限稀釋平行產(chǎn)生的第10天細胞克隆團。27個孔包含單個克隆團，7個孔包含多個克隆團，62個孔不包含克隆團。（C）x.sight和有限稀釋來源的每塊板單細胞克隆率的比較。（D）比較了有限稀釋與x.sight來源的單細胞克隆的存活率。x.sight的平均生存力為84％，而有限稀釋則為81％。（E）比較了從不同類型細胞獲得的單細胞來源孔的生存力。
結(jié)論
本文展示了使用Cytena單細胞打印系統(tǒng)（x.sight）的工作流程，該工作流程可提高單細胞分離的效率并記錄單克隆性。x.sight技術(shù)為單克隆，高效，快速的單細胞接種以及出色的細胞活力以及最小的交叉污染風(fēng)險提供了基于圖像的證據(jù)。單細胞沉積效率高（> 85％），可以更全面地使用微孔板的孔來有效分離單個細胞。在此工作流程中，克隆回收率提高了3倍，這意味著可以在下游分析更多克隆，從而在提高生產(chǎn)率的同時節(jié)省了人工時間和試劑成本。
本文只是嘗試了一種細胞密度來進行單細胞的分選，根據(jù)國內(nèi)外客戶的反饋信息，調(diào)整細胞的密度進行鋪板，單細胞率和克隆生長率能分別提高到95%和91%以上（由于信息保密性，數(shù)據(jù)尚未顯示）。
圖1.上游細胞系開發(fā)中的典型工作流程
Cytena單細胞打印系統(tǒng)（x.sight）是一種創(chuàng)新的噴墨式“打印”分選細胞的設(shè)備，用于從液體樣品中溫和而精確地分離單個細胞。X.sight使用一次性無菌的微流體芯片精確地分離單個細胞，同時在打印不同類型的細胞時也使交叉污染最小化了。
此文展示了使用單細胞打印機和有限稀釋在單細胞沉積效率以及克隆恢復(fù)率的比較。
材料與方法
用于單細胞打印或有限稀釋的細胞制備
對于單細胞打印和有限稀釋，均使用CHO-K1細胞（ATCC），使用的其他細胞系，包括HEK和L929，均以類似方式制備。為了準備單細胞打印，將細胞重懸于PBS中，密度為1 x 10 6細胞/ mL。為了消除細胞團塊，在將樣品裝入打印機芯片之前，通過40 µm過濾器過濾細胞。
通過Cytena單細胞打印系統(tǒng)進行單細胞分選
x.sight可從液體樣品中溫和而精確地分離單個活細胞，該系統(tǒng)使用一次性芯片，可在打印不同類型的細胞時減少了交叉污染。每個芯片可用于一次打印多個96孔或384孔微孔板。為了沉積單個細胞，x.sight通過壓電驅(qū)動的致動器以可預(yù)測的順序產(chǎn)生微液滴（圖2A）。高分辨率相機連續(xù)拍攝芯片噴嘴處的圖像，而成像算法分析噴嘴末端的圖像以檢測單個細胞的存在。當識別到不包含細胞或包含多個細胞的液滴時，真空系統(tǒng)將啟動閥門，從而使這些液滴被虹吸掉。通過算法識別出單個細胞后，將觸發(fā)氣動系統(tǒng)以關(guān)閉真空閥門，從而使包裹單個細胞的液滴在打印機頭移至下一個孔之前掉入下面的孔中。
單細胞來源的克隆性證據(jù)
使用高分辨率相機在噴嘴處對一次性打印芯片成像，以確保細胞出現(xiàn)在聚焦處。當檢測到包含單個細胞的液滴時，將捕獲5個圖像以跟蹤該單細胞下降到噴嘴末端時的狀態(tài)（圖2B）。在液滴形成之前捕獲圖像1-3，在圖像4上，軟件識別確認檢測區(qū)域ROI中的單細胞事件，圖像5顯示液滴噴射之后的噴嘴。注意，基于噴嘴的圖像證據(jù)與在微孔板表面獲得的圖像證據(jù)是互補且具有一致性的。觀察到噴嘴和微孔板圖像之間的高度相關(guān)性為98.9％±1.8（n = 282孔）（數(shù)據(jù)未顯示）。
圖2. Cytena單細胞打印系統(tǒng)技術(shù)
（A）將細胞樣品裝入芯片后，將芯片安裝到單細胞打印系統(tǒng)，然后可以開始打印。在打印過程中，壓電驅(qū)動的致動器會以可預(yù)測的順序連續(xù)產(chǎn)生液滴。使用直接位于噴嘴下方的真空裝置虹吸掉不含細胞或一個以上細胞的液滴。識別出單細胞后，真空系統(tǒng)關(guān)閉，使含單細胞的液滴落入孔中。（B）當檢測到單個細胞時，捕獲五張圖像以提供噴嘴處的克隆性證據(jù)。圖像1-3顯示了在液滴噴射之前細胞的存在，圖像4標記了包含單個細胞的區(qū)域，圖像5顯示了液滴噴射之后的噴嘴。結(jié)果
Cytena單細胞打印系統(tǒng)和有限稀釋的單細胞沉積效率對比
為了評估使用x.sight的單細胞打印效率，分析了芯片噴嘴的圖像，以確保在將液滴噴射到孔中之前觀察到真正的單細胞事件。根據(jù)儀器噴嘴成像的分析結(jié)果，使用x.sight獲得的單細胞打印總效率為88.5％±5.5（n = 9個微孔板）。兩/多細胞孔和無細胞孔的發(fā)生頻率要低得多（分別為6.7％和4.8％）。每個96孔微孔板的平均打印時間為8.1±2.8分鐘。一張圖片說明顯示，x.sight打印至96孔微孔板的典型結(jié)果為85孔包含1個細胞，6孔包含> 1個細胞和5孔不包含細胞（圖3A）。相比之下，理論接種密度為0.5個細胞/孔的有限稀釋液可實現(xiàn)30％的單細胞孔（28個），10％的多細胞孔（10個）和60％的空孔(58個）（圖3B）。圖3c顯示了單細胞打印和有限稀釋的空孔、單細胞孔和多細胞孔效率的直接比較。與有限稀釋相比，x.sight的單細胞沉積效率提高了約3倍，從而增加了用于下游分析的潛在克隆數(shù)。
克隆恢復(fù)率
隨后測試了單細胞打印產(chǎn)生的克隆的生存能力，并將它們與有限稀釋產(chǎn)生的克隆進行了比較。為了量化生存力，將來自有限稀釋或單細胞打印的微孔板定期在成像設(shè)備上成像10天，直到形成明顯的細胞團。圖4A顯示了x.sight的第10天代表性板塊中，包含大量單克隆孔（總共70孔）。圖4B中顯示了有限稀釋的第10天板，其中包含27個單克隆孔。
將來自x.sight和有限稀釋的每孔的克隆團進行計數(shù)，并分類為以下三類之一：空孔，單克隆孔和多克隆孔。觀察到有63.0％±6.5的孔包含單細胞打印產(chǎn)生的單克隆孔（其中1.5％±1.4包含多個克隆，而35.5％±7.3則不含克�。�。同時，觀察到有限稀釋的結(jié)果是26.2％±2.3的孔包含單個克�。ㄆ渲�66.4％±3.9不含克隆，而7.4％±1.9包含多個克�。�。圖4C繪制了來自x.sight和有限稀釋的每塊板的原始單細胞克隆。為了直接測量單細胞活力，在第0天捕獲了熒光標記的細胞，使其生長10天。對于給定的板，通過將單克隆孔的數(shù)目（單細胞孔長起來的）除以單細胞孔的數(shù)目來獲得生存力百分比。x.sight的平均生存力為84％，而極限稀釋度則為81％。同樣，比較了來自x.sight的單細胞來源克隆對不同細胞類型的生存力（圖4E）。通常，使用CHO，HEK和其他常見細胞系時，觀察到的典型生存力大于75％。重要的是要注意，細胞活力會根據(jù)細胞類型，樣品制備，設(shè)定參數(shù)，細胞培養(yǎng)基和其他外部因素而變化。
圖4.單細胞打印機和有限稀釋的存活率對比（A）顯示了來自單細胞打印的第10天細胞團（綠色）。70個孔包含單個克隆團，1個孔包含2個克隆團，25個孔不包含克隆團。（B）有限稀釋平行產(chǎn)生的第10天細胞克隆團。27個孔包含單個克隆團，7個孔包含多個克隆團，62個孔不包含克隆團。（C）x.sight和有限稀釋來源的每塊板單細胞克隆率的比較。（D）比較了有限稀釋與x.sight來源的單細胞克隆的存活率。x.sight的平均生存力為84％，而有限稀釋則為81％。（E）比較了從不同類型細胞獲得的單細胞來源孔的生存力。
結(jié)論
本文展示了使用Cytena單細胞打印系統(tǒng)（x.sight）的工作流程，該工作流程可提高單細胞分離的效率并記錄單克隆性。x.sight技術(shù)為單克隆，高效，快速的單細胞接種以及出色的細胞活力以及最小的交叉污染風(fēng)險提供了基于圖像的證據(jù)。單細胞沉積效率高（> 85％），可以更全面地使用微孔板的孔來有效分離單個細胞。在此工作流程中，克隆回收率提高了3倍，這意味著可以在下游分析更多克隆，從而在提高生產(chǎn)率的同時節(jié)省了人工時間和試劑成本。
本文只是嘗試了一種細胞密度來進行單細胞的分選，根據(jù)國內(nèi)外客戶的反饋信息，調(diào)整細胞的密度進行鋪板，單細胞率和克隆生長率能分別提高到95%和91%以上（由于信息保密性，數(shù)據(jù)尚未顯示）。
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