細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見污染源是防控

廣義上來說，凡是細(xì)胞培養(yǎng)體系中的外來成分或成分變化，都應(yīng)視為污染，細(xì)胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。細(xì)胞污染根據(jù)污染源主要可以分為物理性，化學(xué)性和生物性污染。
1、物理性污染
物理性污染通過影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝，如溫度、放射線、振動(dòng)、輻射(紫外線或熒光)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。常見的例子有：培養(yǎng)箱溫度過高、周圍放置能引起機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備、試劑放在有玻璃門的冰箱中長(zhǎng)期受到光照等。物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。
2、化學(xué)性污染
培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染。化學(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長(zhǎng)輔助因子及儲(chǔ)存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來源。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對(duì)水的污染，在配制液體，清洗容器時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水。細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對(duì)上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時(shí)，正確配置和儲(chǔ)存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計(jì)算錯(cuò)誤，混用類似化合物等錯(cuò)誤。
3、微生物污染
微生物污染的原因可分為2個(gè)階段：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段和實(shí)驗(yàn)操作過程。準(zhǔn)備階段的原因包括：實(shí)驗(yàn)耗材滅菌不徹底；細(xì)胞房清潔度不夠，增加微生物污染風(fēng)險(xiǎn)；超凈臺(tái)潔凈度不夠，消毒不夠徹底，紫外線沒有預(yù)先照射足夠時(shí)間，表面沒有用酒精擦拭；沒有帶無菌乳膠手套；試劑本身已經(jīng)污染，沒有檢測(cè)出來。實(shí)驗(yàn)操作中的污染，往往是不夠嚴(yán)謹(jǐn)，粗心大意造成，如：手從無菌試劑的上方經(jīng)過；移液器操作不當(dāng)，液體接觸到移液器前端；移液管吸液過猛；吸頭忘記更換，導(dǎo)致交叉污染等。
不同的微生物污染物對(duì)細(xì)胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對(duì)細(xì)胞形態(tài)和技能的影響是長(zhǎng)期的、緩慢的和潛在的。而霉菌和細(xì)菌增殖迅速，能在很短的時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)生毒素殺死細(xì)胞。
1）霉菌污染：種類很多，導(dǎo)致細(xì)胞污染的大多是曲霉菌、白色念珠菌、酵母菌、黑霉菌、孢子菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不變混濁。倒置顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長(zhǎng)。處理：確認(rèn)是霉菌污染，如果細(xì)胞種類不是特別的珍貴，直接放棄，并將實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)徹底消毒。萬不得已，可以嘗試抗霉菌素如兩性霉素B來清楚污染，實(shí)際操作中效果很難保證。
2）細(xì)菌污染：細(xì)菌污染較常見的有大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單孢菌等。加用抗菌素的培養(yǎng)液可預(yù)防和排除個(gè)別一般少量細(xì)菌的污染。一旦發(fā)生細(xì)菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短時(shí)間內(nèi)變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯渾濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液起初不混，但稍加震蕩，就有許多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長(zhǎng)并有中毒表現(xiàn)。必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以明確細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而有疑似污染，亦可向肉湯培養(yǎng)基內(nèi)地入少量培養(yǎng)液，37度培養(yǎng)以檢測(cè)。處理：一般用抗生素的常用量的5-10倍作沖擊療法，用藥24-48小時(shí)后再換常規(guī)培養(yǎng)液，有時(shí)在早期污染時(shí)此法有效。
3）支原體污染：支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨(dú)立生活的微生物，約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性，可為圓形、絲狀或梨形，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7．6—8．0)，對(duì)酸耐受性差，對(duì)熱比較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁，多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重情況，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。如何確定是否有支原體污染，一般可用培養(yǎng)法或熒光染色法檢測(cè)，市場(chǎng)上有多種支原體檢測(cè)的試劑盒，本人試用過幾種，先達(dá)基因（gendx.cn）的ERA法支原體快速檢測(cè)試劑盒還不錯(cuò)，兩步操作，20min出結(jié)果，靈敏度較高、速度比較快、操作簡(jiǎn)單靈敏，可檢出的支原體覆蓋范圍非常比較廣，超過130（亞）種。
4、細(xì)胞交叉污染
細(xì)胞污染和細(xì)菌污染不同，細(xì)胞污染是由于在培養(yǎng)過程中各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，而所用器具或液體混雜使用所致。這種污染沒有微生物存在，但使培養(yǎng)細(xì)胞不同種類之間發(fā)生混亂，細(xì)胞生長(zhǎng)特性，形態(tài)發(fā)生變化。污染過的細(xì)胞由于種類不純，無法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
防治及處理：在進(jìn)行多個(gè)種類細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所有器具要嚴(yán)格區(qū)分，對(duì)每一種細(xì)胞按順序進(jìn)行操作，避免一起操作時(shí)造成的混亂；進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，滴管或*頭要及時(shí)更換，避免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液瓶中；所有從別處轉(zhuǎn)來的或是自己所建的細(xì)胞系都要早期留有的充足的凍存儲(chǔ)備，一旦懷疑發(fā)生交叉污染，可做細(xì)胞遺傳學(xué)方面的鑒定，如發(fā)現(xiàn)原有的細(xì)胞遺傳物發(fā)生改變，可以復(fù)蘇早期凍存的細(xì)胞使用。