HINT-快速檢測(cè)和評(píng)價(jià)冠狀病毒藥物的方法實(shí)例

研究設(shè)計(jì)思路
 

選擇DPP4高表達(dá)細(xì)胞類型用于抗體結(jié)合和抑制分析

二肽基肽酶-4 (DPP4)是MERS-CoV進(jìn)入宿主細(xì)胞的受體。為了更好地在細(xì)胞水平研究MERS-CoV，研究者們需先建立DPP4高表達(dá)株。A549, BHK21和VeroE6細(xì)胞被轉(zhuǎn)染了不同濃度的DPP4 質(zhì)粒。兩天后，細(xì)胞被固定和染色。Celigo對(duì)所有樣本進(jìn)行全孔成像并識(shí)別單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)以FCS文件導(dǎo)出至FlowJo 10軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率分析。BHK-21在0.1 µg質(zhì)粒濃度顯示出了最高表達(dá)，因而被選擇用于后續(xù)分析。



優(yōu)化用于抗體結(jié)合和抑制檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)

優(yōu)化細(xì)胞接種密度對(duì)于基于熒光的細(xì)胞分析至關(guān)重要。細(xì)胞數(shù)太少會(huì)降低數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，細(xì)胞數(shù)太高可能會(huì)造成細(xì)胞堆疊，影響分析。研究者們將不同密度的BHK-21細(xì)胞接種過(guò)夜并轉(zhuǎn)染DPP4, 通過(guò)Celigo的明場(chǎng)通道查看和分析細(xì)胞形態(tài)和融合率，最終選擇5×10^3個(gè)細(xì)胞/孔作為最佳接種密度。



開(kāi)發(fā)基于圖像分析的病毒蛋白結(jié)合檢測(cè)方法

為了確定病毒蛋白與DPP4高表達(dá)BHK-21細(xì)胞結(jié)合的適合條件，研究者們對(duì)多個(gè)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化：蛋白構(gòu)建體（MERS-CoV S三聚體或S1單體），蛋白量（0.1–10 µg）和染色方案（AL488抗His-Tag 抗體、不同的MERS-CoV單克隆抗體和AF488抗MERS-CoV S蛋白抗體 ）。在蛋白構(gòu)建體方面，Celigo的熒光細(xì)胞圖片顯示MERS-CoV S三聚體和S1單體都能有效地結(jié)合到細(xì)胞上。然而熒光強(qiáng)度分析說(shuō)明，與S1單體相比，MERS-CoV S三聚體顯示出比對(duì)照組更大的峰移。此外，利用全長(zhǎng)MERS-CoV S三聚體可以評(píng)估抗體與整個(gè)S蛋白的相互作用。因此，MERS-CoV S三聚體被用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

開(kāi)發(fā)基于圖像分析的病毒蛋白結(jié)合抑制檢測(cè)方法

RBD特異性抗體通過(guò)阻斷S蛋白和DPP4的結(jié)合，從而主導(dǎo)了MERS-CoV的宿主免疫原性反應(yīng)�？贵w也可以作用于其他表位，包括NTD和S2區(qū)域。研究者們測(cè)定了結(jié)合MERS-CoV S不同區(qū)域的單克隆抗體抑制MERS-CoV S與DPP4表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合能力。以下的流程圖為該方法的實(shí)驗(yàn)步驟。
 

Celigo通過(guò)綠色（AL488）、紅色（PE）和藍(lán)色（DAPI）熒光通道對(duì)樣本進(jìn)行了全孔成像和分析熒光細(xì)胞圖片顯示D12抗體（RBD特異性）（圖4A，B）和G2抗體（NTD特異性，數(shù)據(jù)未顯示）均以劑量依賴性方式抑制MERS-CoV S蛋白結(jié)合，病毒S蛋白的熒光強(qiáng)度（綠色熒光）隨著抗體濃度的降低而減弱。FlowJo分析結(jié)果表明這兩種抗體具有相似的IC50值（～7.5 nM），和它們已知的與MERS-CoV S的結(jié)合常數(shù)具有可比性 [5]。此結(jié)果與先前證明這些單克隆抗體與MERS-CoV S1結(jié)合的BLI實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。作為陰性對(duì)照，G4抗體的結(jié)合區(qū)域?yàn)镾2,在空間上與RBD-DPP4的相互作用較遠(yuǎn)，因此沒(méi)有顯示出任何抑制作用，如圖4E所示。

用假病毒中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合抑制結(jié)果

以往的研究顯示，測(cè)試的三種單克隆抗體（G2，D12和G4）都可有效中和MERS-CoV假病毒感染天然表達(dá)DPP4的Huh 7.5細(xì)胞 [5]。為了驗(yàn)證抑制結(jié)果的可靠性，研究者們進(jìn)行了MERS-CoV England 1假病毒中和實(shí)驗(yàn)，以確定抗體對(duì)表達(dá)DPP4的BHK21細(xì)胞的中和模式與結(jié)合抑制方式是否相似。正如所預(yù)期的，G2和D12具有相似的中和曲線（圖5），IC50值在0.5–0.8 nM范圍內(nèi)。而G4的IC50（圖5）比D12和G2高一個(gè)數(shù)量級(jí)，與結(jié)合抑制結(jié)果一致。以往的研究也在Huh 7.5細(xì)胞中顯示出D12 / G2和G4之間存在相同數(shù)量級(jí)的差異 [5]。

結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，HINT已被多家機(jī)構(gòu)和制藥公司用于病毒的抗體中和能力檢測(cè)，例如被美國(guó)CDC用于H3N2型甲流病毒 [10], MedImmune用于呼吸道合胞病毒 [11]，中國(guó)食藥監(jiān)局用于H7N9型禽流感病毒等 [12]。HINT中的”Neutralization”（中和）不僅指抗體的中和作用，也可以廣義地理解為非抗體類病毒藥物/疫苗抑制病毒感染細(xì)胞的能力，因此在mRNA、DNA疫苗，佐劑，化學(xué)合成藥物等的評(píng)估中也有很好的應(yīng)用潛力。Celigo全視野細(xì)胞掃描分析儀具有分析整孔細(xì)胞的能力，在96孔板中掃描所有樣品僅需10-15分鐘，并且可以得到細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞形態(tài)和熒光表達(dá)（包括未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，細(xì)胞面積，平均熒光強(qiáng)度和總熒光強(qiáng)度）等結(jié)果。該方法可以快速地優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)，例如細(xì)胞接種密度、細(xì)胞類型、蛋白選擇和染色方法。另外，一塊微孔板上可設(shè)置多個(gè)復(fù)孔和比較各種條件組合，能大大降低實(shí)驗(yàn)成本。Celigo高通量、高速度的特點(diǎn)以及強(qiáng)大的軟件分析能力結(jié)合HINT技術(shù)可加速抗病毒藥物和疫苗的開(kāi)發(fā)，成為研究傳染病的一種有價(jià)值的工具。

Nexcelom Bioscience對(duì)奮戰(zhàn)在防疫一線的醫(yī)護(hù)人員和科研人員工作者致以最高崇高的敬意！同時(shí)為貢獻(xiàn)一份力量，我們將對(duì)所有研究新冠病毒的單位和人員提供力所能及的無(wú)償服務(wù)與幫助。如有任何需要，請(qǐng)歡迎致電021-5886 0038。

愿我們能贏得這場(chǎng)與病毒的較量，挽救和保護(hù)更多的生命！Better tool for better biology for better life！

參考文獻(xiàn)

1. Du L, et al., 2013. Identification of a receptor-binding domain in the S protein of the novel human coronavirus Middle East respiratory syndrome coronavirus as an essential target for vaccine development. J. Virol. 87, 9939-9942.

2. Raj VS, et al., 2013. Dipeptidyl peptidase 4 is a functional receptor for the emerging human coronavirus-EMC. Nature 495, 251.

3. Corti D, et al., 2015. Prophylactic and postexposure efficacy of a potent human monoclonal antibody against MERS coronavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 10473-10478.

4. Johnson RF, et al., 2016. 3B11-N, a monoclonal antibody against MERS-CoV, reduces lung pathology in rhesus monkeys following intratracheal inoculation of MERS-CoV Jordan-n3/2012. Virology 490, 49-58.

5.  Wang L, et al.,2015. Evaluation of candidate vaccine approaches for MERS-CoV. Nat. Commun. 6, 7712.

6. Pallesen J, et al., 2017. Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoV spike antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. 114, E7348-E7357.

7.  Yuan Y, et al., 2015. Structural basis for the neutralization of MERS-CoV by a human monoclonal antibody MERS-27. Sci. Rep. 5, 13133.

8. Chen Y, et al., 2017. A novel neutralizing monoclonal antibody targeting the N-terminal domain of the MERS-CoV spike protein. Emrg. Microbes Infect. 6, e37.

9. Beigel JH, et al., 2018. Safety and tolerability of a novel, polyclonal human anti-MERS coronavirus antibody produced from transchromosomic cattle: a phase 1 randomised, double-blind, single-dose-escalation study. Lancet Infect. Dis. 18, 410-418.

10. Jorquera PA, et al., 2019. Insights into the antigenic advancement of influenza A (H3N2) viruses, 2011-2018. Sci Rep. 9, 2676.

11. Shambaugh C, et al., 2017. Development of a high-throughput respiratory syncytial virus fluorescent focus-based microneutralization assay. 24, e00225-17.

12. Tian Y, et al., 2018. Development of in vitro and in vivo neutralization assays based on the pseudotyped H7N9 virus. Sci Rep. 8, 8484.