揭秘神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中m6A-RNA甲基化與組蛋白修飾間的關(guān)系

文章導(dǎo)讀
表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究在生物發(fā)育和疾病相關(guān)性等方面正越來(lái)越引起人們的關(guān)注。其中m6A修飾的研究是表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。研究表明，m6A標(biāo)簽在mRNA和lncRNA中超過(guò)10,000種，并且m6A參與mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾也成為基因表達(dá)中的一種重要的調(diào)控機(jī)制。m6A的在基因表達(dá)調(diào)控方面功能作用已被廣 泛研究，但它在生物水平上發(fā)展的重要性仍在很大程度上不為人所知。

Nature neuroscience（IF=20.071）上一篇題目為N6-methyladenosine RNA modification regulates embryonic neural stem cell self-renewal through histone modifications的文章。本文結(jié)合m6A-seq, RNA-seq, ChIP-seq等多種技術(shù)探究了RNA甲基化修飾在調(diào)節(jié)組蛋白修飾終影響小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化過(guò)程，為從表觀遺傳學(xué)層面調(diào)控胚胎神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育的研究提供了新的方向。小編今 天將對(duì)這篇結(jié)合了多種分子生物學(xué)研究手段的文章進(jìn)行系統(tǒng)的解析。

發(fā)表期刊：Nature Neuroscience
影響因子：20.071
實(shí)驗(yàn)方法:  m6A-seq, RNA-seq, ChIP（以上服務(wù)云序均可提供）
文章鏈接：N6-methyladenosine RNA modification regulates embryonic neural stem cell self-renewal through histone modifications
研究?jī)?nèi)容
(1) Mettl14基因敲除降低NSC增殖并促進(jìn)NSC提前分化
作者利用基因工程技術(shù)獲得了正常小鼠Mettl14f/f（CK）、敲除Mettl14基因的純合小鼠Mettl14f/f;Nestin-Cre (Mettl14-cKO)和雜合小鼠Mettl14f/+;Nestin-cre。對(duì)這三組小鼠的神經(jīng)球進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)TLC分析不同組中的m6A水平，Mettl14-cKO中的m6A水平極低，得到進(jìn)行m6A在NSC中功能研究的理想株系。作者進(jìn)行了E14.5時(shí)期的體外神經(jīng)元培養(yǎng)，檢測(cè)Mettl14f/f、Mettl14f/f;Nestin-Cre 和Mettl14f/+;Nestin-cre的神經(jīng)元數(shù)量與大小，檢測(cè)到Mettl14-cKO中神經(jīng)元的大小為對(duì)照組的55%。對(duì)NSC細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)證明了Mettl14-cKO的NSC的增殖能力明顯下降。通常細(xì)胞增殖力下降往往伴隨著細(xì)胞的分化提前，作者對(duì)三個(gè)株系的NSCs進(jìn)行Tuj1（神經(jīng)元分化微管蛋白）染色，結(jié)果顯示Mettl14-cKO NSCsTuj1+是對(duì)照組的6.2倍。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明Mettl14-cKO相比于對(duì)照組NSCs的增殖水平下降且分化提前。 （2）Mettl14-cKO小鼠大腦皮層RGC池的大小減少并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化

接著作者在E15.5 ，E17.5小鼠的大腦皮層進(jìn)行不同標(biāo)記染色，Mettl14-cKO中BrdU+（檢測(cè)細(xì)胞增殖的分子標(biāo)記物）細(xì)胞較CK減少19%和40%；磷酸組蛋白H3 （PH3，有絲分裂標(biāo)記物）的細(xì)胞減少44%和45%；Pax6+（胚胎發(fā)育中重要的調(diào)控因子）的數(shù)量減少了14%和45%。說(shuō)明E15.5 ，E17.5時(shí)期Mettl14-cKO小鼠大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力下降，該結(jié)果與體外結(jié)果一致。

IdU（標(biāo)記正在增殖的細(xì)胞）和BrdU皮質(zhì)切片雙染色評(píng)估細(xì)胞周期進(jìn)程，測(cè)定IdU+BrdU -的百分比（代 表增殖細(xì)胞和已經(jīng)離開(kāi)s期的細(xì)胞）。E15.5和E17.5 Mettl14-cKO與CK相比，分別下降了38%和43%，表明Mettl14的丟失擾亂了正常的RGC細(xì)胞周期進(jìn)程。E15.5和E17.5時(shí)期Mettl14-cKO小鼠的BrdU+Ki67-（標(biāo)記增殖周期中的細(xì)胞）皮質(zhì)切片染色信號(hào)分別減少50%和39%，說(shuō)明正常RGC細(xì)胞增殖周期需要Mettl14的調(diào)節(jié)，Mettl14-cKO小鼠皮層RGC池明顯減少。

為評(píng)估伴隨著細(xì)胞增殖減緩，RGC在皮層中是否發(fā)生過(guò)早分化，作者用Tbr2（參與皮質(zhì)細(xì)胞分化）和Neurod2 (ND2，神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞分化)對(duì)E15.5和E17.5時(shí)期Mettl14-cKO小鼠的大腦皮層進(jìn)行檢測(cè)。在E15.5和E17.5時(shí)，在Mettl14-cKO小鼠大腦皮層始終可見(jiàn)ND2+Tbr2+細(xì)胞斑塊，但在相同階段的對(duì)照組小鼠中卻不存在。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明Mettl14-cKO小鼠大腦皮層RGC池的大小減少并伴隨著神經(jīng)干細(xì)胞提前分化。此結(jié)果與體外NSCs的發(fā)育特征一致。

（3）Mettl14缺失導(dǎo)致晚期出生神經(jīng)元數(shù)量減少

在P0小鼠中，作者通過(guò)特定標(biāo)記識(shí)別相應(yīng)的神經(jīng)元亞型，在六個(gè)不同的皮層中發(fā)現(xiàn)了RGCs分化的神經(jīng)元。其中，Cux1在晚期出生的神經(jīng)元中表達(dá)，是II-IV的標(biāo)記物，對(duì)標(biāo)記信號(hào)進(jìn)行定量結(jié)果表明相比于CK小鼠而言Mettl14-cKO小鼠中Cux1+的信號(hào)值下降70%；Sox5是指在早期出生的神經(jīng)元中表達(dá)，是V層的標(biāo)記，圖中結(jié)果顯示Mettl14-cKO與CK之間的Sox5+信號(hào)并無(wú)明顯區(qū)別；Tbr1表示在有絲分裂后的神經(jīng)元中表達(dá)，是VI的標(biāo)記物，結(jié)果與Sox1類似，在Mettl14-cKO中也并無(wú)明顯變化。以上結(jié)果說(shuō)明敲除mettl14基因之后，導(dǎo)致小鼠大腦皮層中晚期出生的神經(jīng)元的數(shù)量下降。 （4）RNA-seq分析敲除Mettl14導(dǎo)致組蛋白修飾在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生改變，從而影響基因表達(dá)
為了進(jìn)一步明確敲除mettl14后小鼠大腦皮層出現(xiàn)NSCs增殖下降以及神經(jīng)元細(xì)胞提前分化的分子機(jī)理，作者對(duì)Mettl14-cKO、CK和雜合小鼠株系的NSCs細(xì)胞分別進(jìn)行了RNA-seq。通過(guò)對(duì)RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)相比于CK和雜合株系，Mettl14-cKO中轉(zhuǎn)錄組表達(dá)發(fā)生明顯的變化。對(duì)發(fā)生變化的基因進(jìn)行GO分析預(yù)測(cè)差異表達(dá)基因的功能，結(jié)果顯示上調(diào)的基因的潛在功能富集在與細(xì)胞分化相關(guān)功能，而下調(diào)的基因功能主要富集在與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因功能。
大量研究表明，組蛋白修飾是哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制，那么m6A是否能通過(guò)mRNA修飾來(lái)改變組蛋白修飾從而影響基因的表達(dá)呢？作者通過(guò)對(duì)NSCs Western Blots，評(píng)估了一組調(diào)控干細(xì)胞活性的組蛋白修飾，包括H3磷酸化，H2A和H2B泛素化，三種組蛋白乙酰化，四種組蛋白甲基化，這些組蛋白標(biāo)記與基因激 活或抑 制有關(guān)。作者量化了western blots結(jié)果，發(fā)現(xiàn)H3K27ac位點(diǎn)在Mettl14-cKO中相比于CK增加了111%，H3K4me3位點(diǎn)增加了43%，H3K27me3增加了71%，說(shuō)明m6A調(diào)節(jié)特異性組蛋白修飾。
為了確定這些變化是否會(huì)改變NSC的增殖，作者用抑 制組蛋白修飾上調(diào)的化學(xué)抑 制劑，以確定E14.5時(shí)期KO小鼠NSCs中抑 制組蛋白修飾上調(diào)是否會(huì)挽救細(xì)胞增殖缺 陷。其中MM102能抑 制H3K4me3的形成（抑 制MLL1基因）；C646能抑 制H3K27乙酰轉(zhuǎn)移酶Crebbp (CBP)/p300活性；GSK343抑 制H3K27me3的形成（抑 制Ezh2基因）。在DMSO處理后，Mettl14-cKO小鼠NSCs的數(shù)量是CK的50%，反映了預(yù)期的增殖緩慢。GSK343處理后將Mettl14-cKO與CK的比例提高，說(shuō)明抑 制H3K27me3的形成可以回復(fù)增殖缺陷。在C646處理后，結(jié)果一樣能夠回復(fù)增殖缺陷。說(shuō)明m6A至少可以通過(guò)H3K27me3和H3K27ac修飾調(diào)控NSC增殖。 為了確定H3K27me3和H3K27ac修飾的目標(biāo)基因，作者對(duì)Mettl14-cKO和CK小鼠的NSCs細(xì)胞進(jìn)行了H3K27me3和H3K27ac的 ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)ChIP-seq結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，作者選擇了H3K27me3調(diào)控的5個(gè)與增殖相關(guān)的基因包括Egr2和Egr3，這些基因在Mettl14-cKO的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中相比于其在CK中的表達(dá)是明顯下調(diào)的，此外也選擇了H3K27ac調(diào)控的5個(gè)與分化相關(guān)的基因包括Kif26a38、Gas739和Pdgfrb40，在Mettl14-cKO的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中相比于其在CK中的表達(dá)是明顯上調(diào)的。其中，H3K27me3通常標(biāo)記基因啟動(dòng)子，與基因沉默相關(guān)，而H3K27ac富集于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)，與基因激 活相關(guān)。那么在E14.5時(shí)期Mettl14-KO和CK的NSCs中增加H3K27me3的啟動(dòng)子是否與基因下調(diào)相關(guān)，而啟動(dòng)子/增強(qiáng)子H3K27ac的增加是否與基因上調(diào)相關(guān)？作者用H2K27ac抑 制劑(C646)或H3K27me3抑 制劑 (GSK343)處理細(xì)胞，C646處理明顯降低了Mettl14-cKO小鼠NSCs中神經(jīng)元分化調(diào)節(jié)因子Kif26a38、Gas739和Pdgfrb40的表達(dá)。而GSK343處理增加了轉(zhuǎn)錄因子Egr2和Egr3（促進(jìn)細(xì)胞增殖)，說(shuō)明m6A調(diào)控組蛋白修飾在NSC基因表達(dá)中的作用。上述結(jié)果表明，敲除Mettl14導(dǎo)致組蛋白修飾（H3K27me3和H3K27ac）在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生改變，從而影響與增殖相關(guān)或分化相關(guān)的基因表達(dá)。

 

（5）m6A調(diào)節(jié)H3K27乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP和p300轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性
既然Mettl14-cKO小鼠中mettl14甲基化水平下降可以影響組蛋白位點(diǎn)（H3K27me3和H3K27ac）的修飾，那么是否調(diào)控組蛋白H3K27me3和H3K27ac位點(diǎn)修飾的酶的的轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性是否受m6A調(diào)節(jié)呢？作者通過(guò)m6A-seq分別測(cè)定了H3K27乙�；�酶CBP/p300 mRNA和H3K27甲基化酶Ezh2/Eed/Suz12 mRNA上m6A修飾水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Mettl14-cKO中相比于CK小鼠而言，H3K27乙�；�酶CBP/p300 mRNA上有20-30%的m6A修飾位點(diǎn)丟失，但H3K27甲基化酶Ezh2/Eed/Suz12 mRNA上m6A修飾水平在Mettl14-cKO與CK小鼠中并沒(méi)有明顯差別。通過(guò)放線菌素D (ActD，抑 制轉(zhuǎn)錄）處理E14.5的KO小鼠的NSCs并在3h和6h后捕獲細(xì)胞來(lái)檢測(cè)mRNA的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，在Mettl14-KO中相比于CK，CBP和p300的mRNA穩(wěn)定性均明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果表明m6A可以調(diào)節(jié)H3K27乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP和p300轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。 技術(shù)路線 總結(jié)
本文作者通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)在敲除了mettl14基因的小鼠中NSC的增殖能力明顯下降并且表現(xiàn)出分化提前的現(xiàn)象，隨后作者通過(guò)RNA-seq分析了在Mettl14-cKO小鼠中的差異表達(dá)基因，并發(fā)現(xiàn)大部分與增殖相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)而與分化相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)m6A-seq發(fā)現(xiàn)調(diào)控H3K27ac組蛋白，隨后結(jié)合H3K27me3和H3K27ac的ChIP-seq，分別找到了5個(gè)受組蛋白修飾H3K27ac調(diào)控的與分化相關(guān)的上調(diào)基因和5個(gè)H3K27me3調(diào)控的與增殖相關(guān)的下調(diào)基因，之后通過(guò)修飾酶CBP和p300受m6A甲基化調(diào)控。通過(guò)上述一系列技術(shù)手段揭示了mettl14基因敲除后小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖下降和分化提前是由于m6A修飾CBP和p300的mRNA水平下降，導(dǎo)致CBP和p300表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)了H3K27乙酰化，H3K27ac又能夠上調(diào)分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致分化提前，而m6A修飾通過(guò)未知機(jī)制促使H3K27me3，H3K27me3能夠抑 制增殖相關(guān)的基因下調(diào)，從而導(dǎo)致增殖受阻。該文章對(duì)m6A調(diào)控NSC的自我更新進(jìn)行了邏輯清晰的闡述，其中將明確的科研思路與m6A-seq, RNA-seq, ChIP-seq等技術(shù)進(jìn)行了完美的結(jié)合，為我們講述了一個(gè)完整的m6A與生物發(fā)育的故事。。。

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