活細(xì)胞顯微成像系統(tǒng)硬件觸發(fā)方案的簡要探討五問匯總

一、顯微鏡各組件工作方式及為什么需要硬件觸發(fā)？

廣州科適特科學(xué)儀器有限公司在為客戶提供顯微鏡及配件和服務(wù)過程中，經(jīng)常有客戶問到為什么顯微鏡需要做硬件觸發(fā)？為了幫助客戶更好的理解顯微鏡，我們整理了此文簡單探討。活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在需要比以往更高的速度和更多的數(shù)據(jù)處理量。本文以尼康顯微鏡為例簡單介紹通過硬件之間的直接信號(hào)觸發(fā)顯微成像設(shè)備。這樣可以盡量地減少延遲，使設(shè)備同步并減少光對樣品的照射。本文簡要說明了尼康的NIS-Elements觸發(fā)工作流程和工作方式，并詳細(xì)介紹了其對于常見的時(shí)間序列采集中的好處。

顯微鏡成像系統(tǒng)是由幾個(gè)硬件設(shè)備一起工作的組合。這些設(shè)備可能包括XY電動(dòng)平臺(tái)，Z軸聚焦驅(qū)動(dòng)器，壓電快速XY​​或Z驅(qū)動(dòng)器，電動(dòng)濾光片輪，光源（落射熒光和透射光）以及檢測器。軟件控制著這些設(shè)備的移動(dòng)，因此在理想的環(huán)境中，檢測器的曝光時(shí)間將成為實(shí)驗(yàn)速度的限制因素。
然而，大部分情況下，當(dāng)使用軟件控制設(shè)備移動(dòng)時(shí)，無法達(dá)到理想的速度。許多具有不同固有速度的設(shè)備速度偏差使得顯微鏡軟件必須通過一系列命令和回調(diào)來調(diào)解設(shè)備移動(dòng)和圖像捕獲。結(jié)果，由于與軟件的交互而產(chǎn)生了速度延遲。對于單個(gè)圖像或簡單的實(shí)驗(yàn)，延遲可能不那么明顯，但是對于大數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)，這種延遲對總體采集時(shí)間的影響可能會(huì)非常顯著。
主機(jī)上的定時(shí)時(shí)鐘頻率最終決定顯微鏡的性能。因此，在同一臺(tái)計(jì)算機(jī)上管理的多個(gè)進(jìn)程很容易影響主機(jī)的高精度定時(shí)。
 
二、解決方案舉例：通過NIS-Elements中的直接硬件觸發(fā)來繞過軟件延遲
當(dāng)今大多數(shù)高性能檢測器和外圍設(shè)備都具有I / O（輸入和輸出）端口，用于直接電壓信號(hào)的設(shè)備力學(xué)控制。例如，大多數(shù)光源具有直接的模擬和TTL（晶體管-晶體管邏輯電路）控制連接器，以及通常的串行通信。但是，商用顯微鏡軟件包通常使用串行通信，該通信僅依賴于計(jì)算機(jī)時(shí)鐘和軟件控制。
尼康的NIS-Elements軟件已經(jīng)使用I/O連接已有相當(dāng)長的一段時(shí)間了，并且會(huì)繼續(xù)擴(kuò)展其功能。該軟件通過使用這些功能提供硬件觸發(fā)功能。直接I/O電壓信號(hào)的連接來實(shí)現(xiàn)快速驅(qū)動(dòng)設(shè)備。設(shè)備控制與信號(hào)采集的同步至關(guān)重要。所有這些信號(hào)都是通過數(shù)字采集接口（DAQ）進(jìn)行管理，以實(shí)現(xiàn)靈活性和便利性。 National Instruments數(shù)據(jù)采集設(shè)備（NIDAQ）上的定時(shí)時(shí)鐘也比主機(jī)PC的定時(shí)時(shí)鐘精確得多。為此，NIS-Elements支持National Instruments NIDAQmx系列設(shè)備。 圖1通過直接的硬件觸發(fā)，曝光信號(hào)以及相關(guān)設(shè)備的運(yùn)動(dòng)情況。該圖顯示了通過硬件觸發(fā)光源，電動(dòng)濾光輪和Z軸電動(dòng)馬達(dá)控制進(jìn)行五通道信號(hào)采集的示例。 NIDAQ監(jiān)測相機(jī)的曝光。 NIDAQ輸出信號(hào)控制激發(fā)波長和持續(xù)時(shí)間，以使它們出現(xiàn)在透射（Tx）光或UV，藍(lán)色，綠色或紅色激發(fā)波長的時(shí)間流逝的后續(xù)幀中。曝光后還會(huì)顯示發(fā)射（Em）濾光輪的位置，由于該設(shè)備的速度較慢，因此移動(dòng)持續(xù)時(shí)間以紅色表示。請注意，在檢測器沒有曝光觸發(fā)時(shí)候，各個(gè)部件移動(dòng)的時(shí)鐘是同步的。最后，壓電Z軸馬達(dá)的位置跟曝光信號(hào)以及幀數(shù)相關(guān)，因此僅在完成一幀循環(huán)后才發(fā)生移動(dòng)。
 
三．NIS-Elements如何執(zhí)行硬件觸發(fā)
通過NIDAQ監(jiān)測到檢測器曝光信號(hào)，并且連接好了外圍硬件設(shè)備，硬件觸發(fā)變得很容易理解了。一個(gè)定義多維實(shí)驗(yàn)的參數(shù)，然后NIS-Elements設(shè)置運(yùn)行的順序。一旦檢測器開始工作，NIDAQ便會(huì)在兩次曝光之間移動(dòng)硬件設(shè)備并在曝光期間控制照明。在這種安排下，檢測器將主控（Master）信號(hào)提供給NIDAQ，而NIDAQ協(xié)調(diào)所有其他外設(shè)的時(shí)鐘和順序（圖1）。
NIDAQ可以進(jìn)行精確的照明控制，只有在檢測器曝光時(shí)才打開光源，而在照相機(jī)不進(jìn)行曝光時(shí)（包括在檢測器的讀出時(shí)間內(nèi)），光源會(huì)立即關(guān)閉。此外，NIDAQ甚至可以自定義曝光應(yīng)在照明內(nèi)激活多長時(shí)間，并且還可以對照明進(jìn)行脈沖控制。這種控制減少了照明的持續(xù)時(shí)間，從而將時(shí)間保持在絕對最短的時(shí)間。對于LED或激光源，開/關(guān)時(shí)間在數(shù)十微秒的范圍內(nèi)。例如目前應(yīng)用最多的CoolLED公司的pE-4000和pE-300光源切換時(shí)間可以達(dá)到20微秒。
硬件觸發(fā)還可通過同時(shí)啟動(dòng)所有設(shè)備來有效執(zhí)行多設(shè)備控制。并行觸發(fā)提高了整體速度，因?yàn)闆]有順序執(zhí)行一個(gè)設(shè)備移動(dòng)另一個(gè)設(shè)備的操作。設(shè)備的定時(shí)和速度也是已知的，因此NIS-Elements甚至可以以重疊（“實(shí)時(shí)”）采集模式運(yùn)行的檢測器的讀出時(shí)間內(nèi)控制設(shè)備移動(dòng)，在這種模式下，檢測器始終在運(yùn)行。

四、簡單經(jīng)濟(jì)的快速觸發(fā)解決方案-CoolLED “Sequence Runner”
 
2020年10月14日，英國Andover–全球LED顯微鏡照明專家CoolLED推出了其新型8通道pE-800 LED照明系統(tǒng) 用于寬視野熒光顯微鏡。 pE-800具有八個(gè)可獨(dú)立控制的LED和閃電般的快速TTL切換功能，以最低的總擁有成本提供了最高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。獨(dú)特的8通道Sequence Runner結(jié)合使用時(shí)，照明序列可以通過相機(jī)中的單個(gè)TTL觸發(fā)，從而將手動(dòng)顯微鏡轉(zhuǎn)變?yōu)閮r(jià)格合理且功能強(qiáng)大的八通道自動(dòng)成像系統(tǒng)。
 
8通道Sequence Runner,通過單個(gè)TTL輸入（例如從攝像頭TTL輸出）通過全局TTL快速控制和同步切換選定的LED及其輻照度，切換速度<7 µs。需要較少的電子硬件。NIS Elements已經(jīng)集成Sequence Runner，如果沒有配置NiDAQ板，這將是一個(gè)非常經(jīng)濟(jì)高效的解決方案。
五、強(qiáng)大的硬件觸發(fā)的顯微鏡主機(jī)架
徠卡DMi8或者奧林巴斯IX83及尼康公司的Ti2-E等倒置顯微鏡擴(kuò)大了硬件觸發(fā)的潛力，Ti2-E倒置顯微鏡支架上的所有電動(dòng)組件都具有硬件觸發(fā)或減少延遲的優(yōu)勢。Ti2-E的關(guān)鍵功能包括本地直接連接檢測器的功能（即使沒有NIDAQ）：顯微鏡本身知道曝光何時(shí)完成并立即執(zhí)行下一個(gè)設(shè)備的動(dòng)作。這提供了一些令很好的功能，例如非�？焖俚淖詣�(dòng)對焦功能。包含NIDAQ也可以通過直接硬件觸發(fā)來啟動(dòng)顯微鏡硬件，從而允許定制的觸發(fā)配置包括顯微鏡硬件和第三方設(shè)備。例如，透射光和落射熒光光源，二向色鏡，壓電Z軸驅(qū)動(dòng)馬達(dá)和發(fā)射濾片轉(zhuǎn)盤都可以一起控制。

尼康顯微鏡系統(tǒng)如果需要實(shí)現(xiàn)硬件觸發(fā)功能，需要配置NIS-Elements AR，C和HC軟件包，NIDAQ和用于觸發(fā)設(shè)備控制的插件。NIS-Elements軟件可以管理越來越多的硬件觸發(fā)的設(shè)備類型（表1），包括CoolLED光源，驅(qū)動(dòng)馬達(dá)，照明模塊，傳感器和信號(hào)發(fā)生器。所有這些設(shè)備都可以用于基本的多維采集實(shí)驗(yàn)，但也可以用于刺激/激活實(shí)驗(yàn)，高容量獲取實(shí)驗(yàn)以及自定義實(shí)驗(yàn)流程（例如光源照明順序），使用戶以完全靈活地控制觸發(fā)的設(shè)備控件，實(shí)驗(yàn)順序和模式。 表1| NIS Elements硬件觸發(fā)的設(shè)備類別

借助尼康的NI觸發(fā)盒（NI-BB）（圖2）等外圍設(shè)備即可輕松進(jìn)行硬件觸發(fā)的設(shè)備配置，NI觸發(fā)盒設(shè)備包括一個(gè)NIDAQ和一個(gè)專用分線盒，帶有預(yù)定義的連接器和電纜，用于XYZ設(shè)備，熒光光源，透射光的LED，濾光片轉(zhuǎn)輪，激光單元，光刺激設(shè)備和Ti2-E觸發(fā)的顯微鏡支架。 NIS-Elements設(shè)備管理器可以很方便的根據(jù)所使用的連接器將NIDAQ的資源分配給每個(gè)連接的設(shè)備。檢測器（最多三個(gè)）也可以輕松連接到控制箱。 圖2 |尼康NI-BB套件通過預(yù)定義的連接器電纜直接連接各種硬件設(shè)備，以便直接觸發(fā)控制。簡化了外圍設(shè)備和NIDAQ的軟件設(shè)置。
 
六、小結(jié)
尼康的NIS-Elements硬件觸發(fā)是一種功能強(qiáng)大而有效的方案，可盡量地減少樣品在光源下的照射時(shí)間，減少或消除兩次激發(fā)之間的時(shí)間延遲，并大大減少整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。表2中顯示了一些典型的實(shí)驗(yàn)示例，比較了相同硬件和設(shè)置。區(qū)別是在Ti2-E倒置顯微鏡上使用直接硬件觸發(fā)和顯微鏡曝光終端感應(yīng)功能的軟觸發(fā)。
硬件觸發(fā)可顯著縮短整體實(shí)驗(yàn)時(shí)間。在大多數(shù)這些示例中，相機(jī)的曝光時(shí)間長于相機(jī)的讀取時(shí)間。最后一行是一個(gè)比較，其相機(jī)曝光時(shí)間與其讀數(shù)相同時(shí)間，并且攝像頭能夠在完全重疊（100％占空比）模式下運(yùn)行。

在采購顯微鏡系統(tǒng)時(shí)，可以考慮將要使用的外圍設(shè)備。具有I/O觸發(fā)功能的設(shè)備（即使最初不使用）也提供了內(nèi)置的升級(jí)途徑。用于硬件觸發(fā)的NI-Elements軟件控件花費(fèi)很小，而且配置簡單。采用硬件觸發(fā)功能的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和控制既合理又簡化，用戶只需觸摸一下按鈕，即可保存和調(diào)用觸發(fā)的設(shè)備配置。