數(shù)字化病理系統(tǒng)中放大倍數(shù)與分辨率的關系
簡介
毫無疑問，在可見的未來，數(shù)字化病理學是病理學的希望。如今許多病理實驗室開始采用這一技術，應用到包括遠程病理學（遠程會診）、定量圖像分析和實驗室工作流程的數(shù)字化。數(shù)字切片掃描系統(tǒng)是數(shù)字化病理的一個重要組成部分，它使以玻璃病理切片為基礎的工作流程轉變?yōu)閿?shù)字工作流程。隨著越來越多的病理實驗室采用數(shù)字病理，經常問的一個關鍵問題是“為什么圖像大小與我的顯微鏡不一樣？例如當用傳統(tǒng)光學顯微鏡的20x物鏡觀察玻璃切片，然后用相同20x物鏡掃描的數(shù)字圖像來觀看時，所感知到的圖像大小可能不相同。
許多病理醫(yī)生第一次用數(shù)字切片時驚訝地發(fā)現(xiàn)，用同一個物鏡獲得的圖像，常規(guī)光學顯微鏡上的與數(shù)字顯示器相比，比例相差如此之大，這是所有數(shù)字病理成像系統(tǒng)中常見的現(xiàn)象。出現(xiàn)這種情況的原因是，全切片圖像（WSI）的大小取決于（1）掃描儀使用的物鏡放大倍數(shù)，（2）數(shù)碼相機傳感器內單個像素的大小和數(shù)量，（3）顯示器單個像素的大小和數(shù)量。圖1所示的圖像說明了這一點。
圖1：使用相似的×20物鏡顯示闌尾中的蟯蟲圖像，但傳感器像素大小不同。
圖1顯示了在兩個不同的WSI掃描系統(tǒng)的圖像。兩臺掃描儀都使用一個×20物鏡來獲取數(shù)字圖像。a的圖像來自掃描儀廠商1，由5.5微米像素傳感器拍攝，b的圖像來自掃描儀廠商2，使用10微米像素大小的傳感器拍攝。顯示在屏幕上，a比b圖像大1.7倍，來自廠商1的掃描儀圖像由于其像素分辨率高而包含更多信息。當以全數(shù)字分辨率觀看時，保持物鏡恒定并改變傳感器中的像素大小將產生不同感知尺寸的圖像。依WSI系統(tǒng)中的數(shù)碼相機和物鏡的數(shù)值孔徑（NA）的不同，圖像的數(shù)字分辨率可能會有很大的不同。
放大率不是分辨率，光學分辨率不是數(shù)字分辨率
另一個重要的考慮因素是放大率和分辨率之間的區(qū)別。在理解這一點之前，我們必須了解數(shù)字分辨率和光學分辨率之間的區(qū)別。本質上，所有的分辨率定義都是描述兩個物體在圖像中可以被區(qū)分的最小距離。例如，使用一個觀察系統(tǒng)，如果兩個物體在“模糊”在一起并顯示為一個物體之前，兩個物體之間的最小距離為1微米，則分辨率為1微米，即系統(tǒng)可以分辨相距1微米的兩個物體。對于沒有傳感器的純光學系統(tǒng)，分辨率取決于光和玻璃光學系統(tǒng)的相互作用，這在顯微鏡中通常被描述為瑞利（Rayleigh）分辨率極限（R）。其計算：
R=0.61λ / NA
如果我們知道光的顏色（綠光的λ約為0.53微米）和玻璃光學元件的性質(數(shù)值孔徑即NA), 數(shù)值孔徑表征物鏡的聚光能力,是物鏡的重要性質之一。理論上NA=nsinθ，因此增大物鏡的數(shù)值孔徑（NA）有兩個途徑：
:⑴ 增大透鏡的直徑或減小物鏡的焦距即設計短焦距的物鏡,以增大孔徑半角θ。但此法會導
致像差增加及制造困難,一般不采用。實際上sinθ的最大值只能達到0.95。
⑵ 增大物鏡與觀察物之間的折射率n。干系物鏡是以空氣為介質的,折射率n=1,一般用于低倍物鏡。油系物鏡常以松柏油(n=1.515,NA=1.4)，圖2顯示這樣關系：
圖2：不同數(shù)值孔徑的物鏡具備不同的分辨率
因此，我們看到基于光學，光圈大小和光的波長都很重要，但這種放大并不直接轉化為解析力或分辨率。因為我們需要更高的分辨率時，會使用更高NA值的物鏡，而通常該物鏡也具有更高的放大倍數(shù)，改變NA和放大倍數(shù)經常同時發(fā)生，所以放大倍數(shù)與分辨率或解析力往往讓人混淆和困惑。例如，從0.5NA物鏡的×20轉換為0.9NA的×40物鏡時，最小分辨率從0.64微米提升到0.36微米（對于綠光）。對于0.9NA物鏡，與0.5NA物鏡相比，得到了更高的分辨率，真正的分辨率提高來自于NA的增加，而不是放大倍數(shù)的增加。
當涉及到數(shù)碼相機傳感器和顯示器器時，分辨率不再僅僅由光學鏡頭決定。這是因為像素的大小和像素的數(shù)量也決定了兩個物體是否會作為單獨或分開的物體顯示出來。使用上述例子，如果兩個物體在投射到傳感器上時相距1微米（被物鏡“放大”后），像素大小為10微米，則這兩個物體很可能看起來是一個。這意味著傳感器無法解析1微米大小的圖像特征[圖。在本例中，傳感器需要0.5微米的像素大小，以確保兩個物體顯示為兩個不同的物體， 而不是融合在一起不能分辨。根據(jù)Nyquist公式，像素大小（P）有以下公式表達：
P=R /2=0.3λ/NA
光學分辨率僅取決于物鏡和光的顏色，而數(shù)字分辨率則取決于物鏡、數(shù)碼相機傳感器和顯示器，并且在整體系統(tǒng)性能方面三者密切交織在一起。物鏡必須具有“看到”感興趣特征所需的光學分辨率；數(shù)字分辨率無法彌補物鏡的不足。然而，如果傳感器的數(shù)字分辨率不夠好，傳感器可能會使玻璃物鏡的優(yōu)勢喪失。
放大的作用
放大是指物體表面尺寸的變化，使物體更容易被看見。在用于病理學的傳統(tǒng)光學顯微鏡中，使用一系列放大倍數(shù)的物鏡，以確保通過肉眼觀察到的圖像足夠大，便于觀察。在這種情況下，放大不一定用來提高分辨率，而是用來使觀看更容易。在WSI系統(tǒng)中，隨著數(shù)碼相機傳感器和顯示器的引入，放大倍數(shù)起到了匹配數(shù)碼分辨率和光學分辨率的作用。在前面的例子中，我們不能用10微米分辨率的傳感器看到1微米大小的物體，除非我們將圖像放大20倍。一旦傳感器以良好的保真度將圖像數(shù)字化，就不再需要額外的放大，圖像是否大小合適且易于查看現(xiàn)在取決于顯示器了。數(shù)字顯示器上的圖像可能與傳統(tǒng)的光學顯微鏡圖像有很大不同，不再是病理醫(yī)生平時熟悉的常規(guī)光學顯微鏡視野圖像，病理醫(yī)生需要盡快熟悉新的數(shù)字環(huán)境。
圖3：顯示工作站顯示器器增加的放大倍數(shù)的圖形
傳統(tǒng)的顯微鏡提供了一對10x的目鏡供觀察，從而在觀察切片時提供了額外的放大倍數(shù)。類似地，在顯示器上顯示數(shù)字圖像可以額外放大倍數(shù)[圖-即數(shù)字放大。前面10微米像素的例子中，當這個像素值移動到一個典型的工作站顯示器上時，它通常會顯示為270微米的像素，意味著數(shù)字放大倍數(shù)為27x，比以前用肉眼鏡檢所達到的放大倍數(shù)還要高。如果我們用一個更常用的傳感器（例如像素尺寸6.45微米）），放大系數(shù)變?yōu)閪42x，因此，如果不考慮物鏡的放大倍數(shù)，很明顯，圖像的大小比例肯定會有所不同，取決于所使用的傳感器。計算機屏幕上圖像的放大率還受觀看圖像的人離顯示器屏幕遠近，你坐得越遠，圖像看起來越小。
總結
數(shù)字病理成像系統(tǒng)的圖像放大是一個復雜問題。數(shù)字病理圖像查看與傳統(tǒng)顯微鏡檢查之間存在差異，是必然的，可能導致供應商和病理醫(yī)生之間的相互不了解。最重要的是WSI不同于傳統(tǒng)的顯微鏡，它有額外的傳感器和顯示器。傳統(tǒng)的光學顯微鏡圖像質量名稱可能不再適用于數(shù)字WSI；與其使用“40x”，更可取和科學的做法是使用可在不同系統(tǒng)之間進行比較的標準來表示圖像質量，微米/像素將可能被更廣泛和更恰當?shù)赜糜诒硎緮?shù)字圖像中的特征。微米/像素是比“放大率”更好的、獨立于各個生產商的指標，應被視為未來數(shù)字病理系統(tǒng)的標準。市場上各種數(shù)字病理系統(tǒng)之間的分辨率可能不同，微米/像素的顯示可以幫助計算機輔助診斷（CAD）結果標準化，因為它顯示分辨率。提供較低微米/像素值的WSI掃描儀讓病理醫(yī)生從圖像中獲取更多信息，病理醫(yī)生可能提供更快的診斷，因為更少的讀片時間，節(jié)省大量的時間。
毫無疑問，在可見的未來，數(shù)字化病理學是病理學的希望。如今許多病理實驗室開始采用這一技術，應用到包括遠程病理學（遠程會診）、定量圖像分析和實驗室工作流程的數(shù)字化。數(shù)字切片掃描系統(tǒng)是數(shù)字化病理的一個重要組成部分，它使以玻璃病理切片為基礎的工作流程轉變?yōu)閿?shù)字工作流程。隨著越來越多的病理實驗室采用數(shù)字病理，經常問的一個關鍵問題是“為什么圖像大小與我的顯微鏡不一樣？例如當用傳統(tǒng)光學顯微鏡的20x物鏡觀察玻璃切片，然后用相同20x物鏡掃描的數(shù)字圖像來觀看時，所感知到的圖像大小可能不相同。
許多病理醫(yī)生第一次用數(shù)字切片時驚訝地發(fā)現(xiàn)，用同一個物鏡獲得的圖像，常規(guī)光學顯微鏡上的與數(shù)字顯示器相比，比例相差如此之大，這是所有數(shù)字病理成像系統(tǒng)中常見的現(xiàn)象。出現(xiàn)這種情況的原因是，全切片圖像（WSI）的大小取決于（1）掃描儀使用的物鏡放大倍數(shù)，（2）數(shù)碼相機傳感器內單個像素的大小和數(shù)量，（3）顯示器單個像素的大小和數(shù)量。圖1所示的圖像說明了這一點。
圖1：使用相似的×20物鏡顯示闌尾中的蟯蟲圖像，但傳感器像素大小不同。
圖1顯示了在兩個不同的WSI掃描系統(tǒng)的圖像。兩臺掃描儀都使用一個×20物鏡來獲取數(shù)字圖像。a的圖像來自掃描儀廠商1，由5.5微米像素傳感器拍攝，b的圖像來自掃描儀廠商2，使用10微米像素大小的傳感器拍攝。顯示在屏幕上，a比b圖像大1.7倍，來自廠商1的掃描儀圖像由于其像素分辨率高而包含更多信息。當以全數(shù)字分辨率觀看時，保持物鏡恒定并改變傳感器中的像素大小將產生不同感知尺寸的圖像。依WSI系統(tǒng)中的數(shù)碼相機和物鏡的數(shù)值孔徑（NA）的不同，圖像的數(shù)字分辨率可能會有很大的不同。
放大率不是分辨率，光學分辨率不是數(shù)字分辨率
另一個重要的考慮因素是放大率和分辨率之間的區(qū)別。在理解這一點之前，我們必須了解數(shù)字分辨率和光學分辨率之間的區(qū)別。本質上，所有的分辨率定義都是描述兩個物體在圖像中可以被區(qū)分的最小距離。例如，使用一個觀察系統(tǒng)，如果兩個物體在“模糊”在一起并顯示為一個物體之前，兩個物體之間的最小距離為1微米，則分辨率為1微米，即系統(tǒng)可以分辨相距1微米的兩個物體。對于沒有傳感器的純光學系統(tǒng)，分辨率取決于光和玻璃光學系統(tǒng)的相互作用，這在顯微鏡中通常被描述為瑞利（Rayleigh）分辨率極限（R）。其計算：
R=0.61λ / NA
如果我們知道光的顏色（綠光的λ約為0.53微米）和玻璃光學元件的性質(數(shù)值孔徑即NA), 數(shù)值孔徑表征物鏡的聚光能力,是物鏡的重要性質之一。理論上NA=nsinθ，因此增大物鏡的數(shù)值孔徑（NA）有兩個途徑：
:⑴ 增大透鏡的直徑或減小物鏡的焦距即設計短焦距的物鏡,以增大孔徑半角θ。但此法會導
致像差增加及制造困難,一般不采用。實際上sinθ的最大值只能達到0.95。
⑵ 增大物鏡與觀察物之間的折射率n。干系物鏡是以空氣為介質的,折射率n=1,一般用于低倍物鏡。油系物鏡常以松柏油(n=1.515,NA=1.4)，圖2顯示這樣關系：
圖2：不同數(shù)值孔徑的物鏡具備不同的分辨率
因此，我們看到基于光學，光圈大小和光的波長都很重要，但這種放大并不直接轉化為解析力或分辨率。因為我們需要更高的分辨率時，會使用更高NA值的物鏡，而通常該物鏡也具有更高的放大倍數(shù)，改變NA和放大倍數(shù)經常同時發(fā)生，所以放大倍數(shù)與分辨率或解析力往往讓人混淆和困惑。例如，從0.5NA物鏡的×20轉換為0.9NA的×40物鏡時，最小分辨率從0.64微米提升到0.36微米（對于綠光）。對于0.9NA物鏡，與0.5NA物鏡相比，得到了更高的分辨率，真正的分辨率提高來自于NA的增加，而不是放大倍數(shù)的增加。
當涉及到數(shù)碼相機傳感器和顯示器器時，分辨率不再僅僅由光學鏡頭決定。這是因為像素的大小和像素的數(shù)量也決定了兩個物體是否會作為單獨或分開的物體顯示出來。使用上述例子，如果兩個物體在投射到傳感器上時相距1微米（被物鏡“放大”后），像素大小為10微米，則這兩個物體很可能看起來是一個。這意味著傳感器無法解析1微米大小的圖像特征[圖。在本例中，傳感器需要0.5微米的像素大小，以確保兩個物體顯示為兩個不同的物體， 而不是融合在一起不能分辨。根據(jù)Nyquist公式，像素大小（P）有以下公式表達：
P=R /2=0.3λ/NA
光學分辨率僅取決于物鏡和光的顏色，而數(shù)字分辨率則取決于物鏡、數(shù)碼相機傳感器和顯示器，并且在整體系統(tǒng)性能方面三者密切交織在一起。物鏡必須具有“看到”感興趣特征所需的光學分辨率；數(shù)字分辨率無法彌補物鏡的不足。然而，如果傳感器的數(shù)字分辨率不夠好，傳感器可能會使玻璃物鏡的優(yōu)勢喪失。
放大的作用
放大是指物體表面尺寸的變化，使物體更容易被看見。在用于病理學的傳統(tǒng)光學顯微鏡中，使用一系列放大倍數(shù)的物鏡，以確保通過肉眼觀察到的圖像足夠大，便于觀察。在這種情況下，放大不一定用來提高分辨率，而是用來使觀看更容易。在WSI系統(tǒng)中，隨著數(shù)碼相機傳感器和顯示器的引入，放大倍數(shù)起到了匹配數(shù)碼分辨率和光學分辨率的作用。在前面的例子中，我們不能用10微米分辨率的傳感器看到1微米大小的物體，除非我們將圖像放大20倍。一旦傳感器以良好的保真度將圖像數(shù)字化，就不再需要額外的放大，圖像是否大小合適且易于查看現(xiàn)在取決于顯示器了。數(shù)字顯示器上的圖像可能與傳統(tǒng)的光學顯微鏡圖像有很大不同，不再是病理醫(yī)生平時熟悉的常規(guī)光學顯微鏡視野圖像，病理醫(yī)生需要盡快熟悉新的數(shù)字環(huán)境。
圖3：顯示工作站顯示器器增加的放大倍數(shù)的圖形
傳統(tǒng)的顯微鏡提供了一對10x的目鏡供觀察，從而在觀察切片時提供了額外的放大倍數(shù)。類似地，在顯示器上顯示數(shù)字圖像可以額外放大倍數(shù)[圖-即數(shù)字放大。前面10微米像素的例子中，當這個像素值移動到一個典型的工作站顯示器上時，它通常會顯示為270微米的像素，意味著數(shù)字放大倍數(shù)為27x，比以前用肉眼鏡檢所達到的放大倍數(shù)還要高。如果我們用一個更常用的傳感器（例如像素尺寸6.45微米）），放大系數(shù)變?yōu)閪42x，因此，如果不考慮物鏡的放大倍數(shù)，很明顯，圖像的大小比例肯定會有所不同，取決于所使用的傳感器。計算機屏幕上圖像的放大率還受觀看圖像的人離顯示器屏幕遠近，你坐得越遠，圖像看起來越小。
| 表1：顯示器分辨率和相機傳感器對放大率的影響。每像素的微米是掃描儀分辨率的最佳指標。計算中使用了96 dpi的標準監(jiān)視器分辨率 | |||||
| 物鏡倍率 | 感光相機 | 60cm外放大倍率 | 大小(微米) |
微米/像素 | |
| 廠商1 | 1.25 | 5.5 | 3 | 8.800 | 4.400 |
| 20 | 5.5 | 40 | 0.550 | 0.275 | |
| 40 | 5.5 | 80 | 0.275 | 0.138 | |
| 廠商2 | 1.25 | 6.5 | 2 | 10.400 | 5.200 |
| 20 | 6.5 | 34 | 0.650 | 0.325 | |
| 40 | 6.5 | 68 | 0.325 | 0.163 | |
| 廠商3 | 1.25 | 7.4 | 2 | 11.840 | 5.920 |
| 20 | 7.4 | 30 | 0.740 | 0.370 | |
| 40 | 7.4 | 60 | 0.370 | 0.185 | |
| 泰立瑞 | 1.25 | 10 | 1 | 16.000 | 8.000 |
| 20 | 10 | 22 | 1.000 | 0.500 | |
| 40 | 10 | 44 | 0.500 | 0.25 | |
總結
數(shù)字病理成像系統(tǒng)的圖像放大是一個復雜問題。數(shù)字病理圖像查看與傳統(tǒng)顯微鏡檢查之間存在差異，是必然的，可能導致供應商和病理醫(yī)生之間的相互不了解。最重要的是WSI不同于傳統(tǒng)的顯微鏡，它有額外的傳感器和顯示器。傳統(tǒng)的光學顯微鏡圖像質量名稱可能不再適用于數(shù)字WSI；與其使用“40x”，更可取和科學的做法是使用可在不同系統(tǒng)之間進行比較的標準來表示圖像質量，微米/像素將可能被更廣泛和更恰當?shù)赜糜诒硎緮?shù)字圖像中的特征。微米/像素是比“放大率”更好的、獨立于各個生產商的指標，應被視為未來數(shù)字病理系統(tǒng)的標準。市場上各種數(shù)字病理系統(tǒng)之間的分辨率可能不同，微米/像素的顯示可以幫助計算機輔助診斷（CAD）結果標準化，因為它顯示分辨率。提供較低微米/像素值的WSI掃描儀讓病理醫(yī)生從圖像中獲取更多信息，病理醫(yī)生可能提供更快的診斷，因為更少的讀片時間，節(jié)省大量的時間。
