無縫克隆-讓載體構(gòu)建如此簡單

基因克隆或分子克隆，是應(yīng)用酶學(xué)方法在體外將不同來源的DNA分子重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進行擴增，形成大量子代DNA分子的過程。

基因克隆方法經(jīng)過幾十年的發(fā)展，從傳統(tǒng)的DNA連接酶介導(dǎo)的平粘末端克隆及TA克隆技術(shù)，到基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的TOPO克隆技術(shù)，再到基于DNA重組酶的Gateway重組和無縫克隆技術(shù)。相比之下，無縫克隆操作更加簡單，靈活性更強，同時幾乎不受序列的限制，一次可定向組裝多個片段的dsDNA。

無縫克隆的原理
與傳統(tǒng)的雙酶切克隆類似，無縫克隆同樣需要依賴于dsDNA的黏性末端進行互補配對，并利用DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵修復(fù)缺口。但是，無縫克隆并不使用“內(nèi)切酶”來制造黏性末端，而是通過“外切酶”T5核酸外切酶來產(chǎn)生的，它能沿著5’→3’方向，降解dsDNA，從而產(chǎn)生黏性末端。我們可以通過PCR的方法，在外源拼接片段的兩端加上線性化載體的序列，在T5外切酶作用下，就能產(chǎn)生幾乎一致的黏性末端。相同的黏性末端互補配對之后，借助DNA聚合酶進行修復(fù)添加缺失的堿基。最后一步借助Taq DNA連接酶，催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補齊。
 

無縫克隆的優(yōu)勢
1.不受片段序列的限制、實現(xiàn)任意組裝。
傳統(tǒng)的酶切克隆，會受到酶切位點的限制。而無縫克隆不依賴于限制性內(nèi)切酶，僅需通過引物制作同源臂，只要一個試劑盒就可解決所有克隆實驗。

2.同時無縫地拼接多個片段。
傳統(tǒng)的酶切克隆，由于酶切位點限制，能組裝的片段數(shù)量有限且在片段與片段之間產(chǎn)生“縫隙”。多片段拼接操作復(fù)雜，效率也較低。而無縫克隆可通過一步反應(yīng)輕松拼接4-5個片段，最高可達10個。

3.節(jié)省時間，操作簡便。
傳統(tǒng)的酶切克隆，首先需要進行PCR，膠回收，然后酶切載體和外源片段，再純化、連接、轉(zhuǎn)化。如果需要進行多片段組裝，還要花費更多時間。而無縫克隆僅需PCR和純化或膠回收，隨后即可直接進行一步多片段拼接。

無縫克隆實驗流程及設(shè)計方法
麥伯生物的Magic MultiS One Step Cloning kit 產(chǎn)品在30分鐘內(nèi)可以將一個或多個PCR擴增片段（平端）克隆插入任意載體的任意位置，室溫孵育即可完成片段的連接，高效，準(zhǔn)確，克隆陽性率可達95%以上。實驗流程如下圖：
 

引物設(shè)計原則：通過在引物5’端引入線性化克隆載體末端同源序列，使擴增產(chǎn)物之間以及擴增產(chǎn)物與線性化克隆載體之間都具有能夠相互同源重組的完全一致的序列 (15 bp～25 bp)。
 

麥伯應(yīng)用實例

1. 使用麥伯生物的Magic MultiS One Step Cloning kit進行單片段及多片段重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，平板上均可產(chǎn)生較多單克隆，無插入片段的陰性對照版上幾乎無克隆產(chǎn)生。
 

2. 單片段轉(zhuǎn)化板挑取20個單克隆進行菌落PCR，克隆陽性率達95%以上。
 

3.  4片段重組轉(zhuǎn)化板挑取15個單克隆進行菌落PCR，克隆陽性率達85%以上。