簡(jiǎn)化微生物實(shí)驗(yàn)室的MALDI工作流程

基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）作為微生物鑒定技術(shù)，應(yīng)用已有十多年了，傳統(tǒng)生化方法需要數(shù)天時(shí)間才能得出結(jié)果，而且往往缺乏特異性，而MALDI-TOF 質(zhì)譜儀則克服了上述局限性。MALDI作為一種用于質(zhì)譜（MS）的軟電離方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子（如DNA、核糖體蛋白質(zhì)、肽和糖）以及有機(jī)大分子（如聚合物和其它大分子）的分析。MALDI-TOF質(zhì)譜儀也因此成為當(dāng)今最先進(jìn)的利用蛋白質(zhì)組指紋技術(shù)鑒定細(xì)菌、酵母和真菌的技術(shù)。

快速準(zhǔn)確的分析、便捷的樣品制備以及簡(jiǎn)便的結(jié)果生成，使得MALDI-TOF質(zhì)譜儀非常適合于常規(guī)的和高通量的微生物鑒定。為此，微生物樣品點(diǎn)在MALDI-TOF質(zhì)譜儀靶板上的點(diǎn)位，并在分析前以特定的MALDI基質(zhì)覆蓋，隨后將所獲得的質(zhì)譜圖譜與參考譜庫進(jìn)行匹配。MALDI-TOF 質(zhì)譜儀靶板通常采用金屬、塑料或陶瓷，可將MALDI-TOF 質(zhì)譜樣品點(diǎn)在單個(gè)點(diǎn)位上用于分析。MALDI-TOF 質(zhì)譜儀靶板主要有兩種類型，即一次性靶板和可重復(fù)使用靶板。其關(guān)鍵的區(qū)別在于，可重復(fù)使用靶板需要在每次試驗(yàn)之間進(jìn)行徹底的清潔和檢查，而一次性靶板則即時(shí)可用。本文將討論一次性靶板在經(jīng)濟(jì)、方便的微生物鑒定工作流程中的優(yōu)勢(shì)。
 
快速、穩(wěn)定的工作流程
在中、高通量實(shí)驗(yàn)室（例如在制藥或食品工業(yè)）中，快速微生物鑒定是質(zhì)量控制（QC）和及時(shí)交付所必需的，因此，高效、方便、快捷的工作流程至關(guān)重要。此外，在受到高度管制的行業(yè)（如制藥行業(yè)），QC方法必須通過實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證�？芍貜�(fù)使用的MALDI鋼質(zhì)靶板由微生物實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)，因?yàn)樗鼈冃枰�一個(gè)必須經(jīng)常被記錄的額外清潔步驟，作為遵循清潔程序的審查證據(jù)。然而，使用一次性靶板可直接支持規(guī)定環(huán)境下的工作流程，如ISO 15189。

一次性靶板可減輕清潔程序驗(yàn)證的負(fù)擔(dān)，降低先前樣本的污染和記憶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，當(dāng)使用一次性MALDI靶板時(shí)，基于MALDI的工作流中有關(guān)質(zhì)量管理（Quality Management, QM）的部分變得更加簡(jiǎn)便，并能為管理和實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)節(jié)省時(shí)間，更能專注于其核心任務(wù)。

此外，這種即時(shí)可用的概念在需要檢測(cè)緊急樣品的情況下尤其有利；例如，在食品工業(yè)中，要求快速識(shí)別微生物污染，以決定是否召回或保留市場(chǎng)上的產(chǎn)品。

除了可重復(fù)使用靶板所需的額外清潔步驟外，一次性和可重復(fù)使用MALDI-TOF 質(zhì)譜儀靶板的工作流是相同的，這使得在保持鑒定程序不變的情況下進(jìn)行靶板切換變得簡(jiǎn)單。此外，一次性靶板能提供與可重復(fù)使用靶板相同的性能表現(xiàn)。

在MALDI-TOF質(zhì)譜儀市場(chǎng)上，有一系列不同尺寸和材質(zhì)的一次性MALDI靶板供應(yīng)。影響MALDI-TOF 質(zhì)譜儀微生物鑒定的穩(wěn)定性的重要因素之一，靶板表面的平整度。某些材料，如塑料，更易受到表面微小變化的影響，這可能導(dǎo)致譜圖中的質(zhì)量偏差，并需要額外的校準(zhǔn)孔。相反，構(gòu)建在陶瓷基底上的靶板（圖1），具有完美的平整表面，無需預(yù)先確定校準(zhǔn)位置，具有可在靶板上的任何位置應(yīng)用校準(zhǔn)物的靈活性，且整個(gè)一次性靶板都可以使用。在整個(gè)靶板上只需要一個(gè)校準(zhǔn)位置就可以獲得很好的質(zhì)量精度，這意味著有更多的點(diǎn)位可用于樣品檢測(cè)。此外，陶瓷材料非常堅(jiān)固，因此，萬一靶板從實(shí)驗(yàn)臺(tái)掉到地板上也不會(huì)斷裂。當(dāng)一次性靶板尚未完全點(diǎn)滿樣本時(shí)，使用單個(gè)靶板進(jìn)行多次MALDI-TOF采集，在軟件和工作流程上并無限制。例如，用戶可以先僅點(diǎn)樣幾個(gè)樣本并完成MALDI運(yùn)行，隨后可再回來使用該靶板的空余位置點(diǎn)上其它的樣本并做檢測(cè)。
 
成本因素
雖然一次性MALDI-TOF質(zhì)譜儀靶板的前期成本可能稍高，但不存在使用或維護(hù)方面的隱藏成本。相比之下，對(duì)于可重復(fù)使用靶板，實(shí)驗(yàn)室可能需要購買、儲(chǔ)存、使用并處置清潔程序所需的一系列有機(jī)化學(xué)品。除了所涉財(cái)務(wù)問題外，還需要額外考慮有機(jī)清潔溶劑，例如通風(fēng)柜的使用及其維護(hù)、工作人員的額外安全協(xié)議以及適當(dāng)?shù)奶幹么胧��?br />
總之，在與可重復(fù)使用靶板進(jìn)行直接成本比較時(shí)，需要考慮實(shí)驗(yàn)室訂購、維護(hù)和處理此“日常運(yùn)營(yíng)”所需的全部時(shí)間。此外，有機(jī)溶劑的可用性和價(jià)格波動(dòng)，也會(huì)給負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室?guī)齑娴娜藛T帶來挑戰(zhàn)，且有時(shí)很難預(yù)測(cè)未來的成本。
 
樣品制備
在高通量的實(shí)驗(yàn)室里，微生物學(xué)家們可以通過使用一次性陶瓷靶板來節(jié)省等待液體樣本干燥的時(shí)間，在陶瓷靶板表面干燥要比在不銹鋼靶板表面快10%左右。
這些一次性靶板采用了旨在提供環(huán)繞親水性樣品位置或“錨點(diǎn)”的疏水表面的技術(shù)。這使得液體樣品能夠均勻地分布在靶點(diǎn)上，而不會(huì)在點(diǎn)位之間產(chǎn)生交叉污染（圖2）。避免靶板上各點(diǎn)位之間的交叉污染，是MALDI-TOF 質(zhì)譜儀微生物鑒定工作流程的關(guān)鍵。
這種技術(shù)特別適用于慢干的液體樣品的制備，這些樣品更容易在各點(diǎn)位之間流動(dòng)并造成交叉污染。由于液滴在疏水邊緣停止擴(kuò)散并停留在親水錨點(diǎn)上，因此用戶能更容易地將樣本點(diǎn)在靶點(diǎn)上，避免了液滴在靶點(diǎn)上流動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)。最后，對(duì)于需要添加更大體積（如3-5µl的樣本）的特殊樣品方案，錨定效應(yīng)使大體積液滴集中于各自的點(diǎn)位，而不存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。
   
流程簡(jiǎn)便的關(guān)鍵
即時(shí)可用的功能和簡(jiǎn)化的工作流程，能帶來節(jié)省時(shí)間的益處，使一次性MALDI-TOF 靶板成為了中、高通量微生物實(shí)驗(yàn)室的便捷解決方案。為了提高效率和節(jié)省時(shí)間，一次性靶板可與現(xiàn)成的細(xì)菌試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品（BTS）及預(yù)配制的HCCA（α-氰基-4-羥基肉桂酸）基質(zhì)一起使用，以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、安全、快速和準(zhǔn)確的微生物鑒定。