光片顯微鏡技術(shù)小課堂（五）—— 數(shù)據(jù)的處理

 處理數(shù)據(jù)

應(yīng)對(duì)高速且大量的數(shù)據(jù)

光片顯微鏡的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是能夠在數(shù)小時(shí)（或數(shù)天）內(nèi)以非常高的時(shí)間與空間分辨率對(duì)大樣本進(jìn)行成像，但由此導(dǎo)致的結(jié)果是會(huì)產(chǎn)生巨大的數(shù)據(jù)量，很容易達(dá)到TB級(jí)別，于是樣本成像的速度不再受圖像采集速度的限制，而是受數(shù)據(jù)處理電腦、存儲(chǔ)容量和數(shù)據(jù)傳輸速度的限制。

當(dāng)以中等幀速成像時(shí)，相機(jī)采集的數(shù)據(jù)可以簡(jiǎn)單地通過(guò)消費(fèi)級(jí)市場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn)的連接（例如USB或FireWire）傳輸?shù)讲杉�電腦的存儲(chǔ)磁盤(pán)，甚至使用網(wǎng)絡(luò)連接傳輸?shù)皆贫说钠胀ù鎯?chǔ)電腦。如果使用速度更快的相機(jī)，數(shù)據(jù)傳輸速度將會(huì)成為限制。有些相機(jī)允許圖像數(shù)據(jù)流保存到內(nèi)部存儲(chǔ)器，需要在采集后讀出；其他相機(jī)則選擇采用更快的數(shù)據(jù)連接，這在大多數(shù)情況下需要在計(jì)算機(jī)中安裝額外的硬件（圖像采集卡）。然后，數(shù)據(jù)流要么傳輸?shù)阶銐虼蟮闹鞔鎯?chǔ)器，要么以同樣快的速度（避免數(shù)據(jù)丟失）傳輸?shù)綄Ｓ玫臄?shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備。

還有一種辦法則是通過(guò)圖像壓縮來(lái)降低數(shù)據(jù)量。圖像數(shù)據(jù)可以在相機(jī)、圖像采集卡、處理器（CPU）或圖形處理卡（GPU）中壓縮。這樣的確能直接減輕數(shù)據(jù)傳輸和存儲(chǔ)系統(tǒng)的壓力，但增加了對(duì)壓縮和隨后解壓縮的處理能力的需求。

解決數(shù)據(jù)量問(wèn)題的一個(gè)更有效的選擇是在拍攝前預(yù)定義感興趣的區(qū)域（ROI），并僅存儲(chǔ)這些區(qū)域的數(shù)據(jù)。這種實(shí)時(shí)處理的方法一般是為特定的某個(gè)標(biāo)本或科學(xué)問(wèn)題定制的，但可以使圖像數(shù)據(jù)本身減少很多。同時(shí)，在處理過(guò)程中數(shù)據(jù)已經(jīng)很好地被可視化，以便于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。理想情況下，顯微鏡（或相機(jī)）應(yīng)該直接輸出預(yù)處理和壓縮后的數(shù)據(jù)，或者，如果可能的話，直接輸出最終結(jié)果（圖5-1）。

（圖5-1）

圖 5-1 處理光片顯微鏡數(shù)據(jù)集

 光片顯微鏡所產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)需要強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理基礎(chǔ)設(shè)施。傳統(tǒng)的成像實(shí)驗(yàn)方法（頂行）是從相機(jī)獲取樣本的圖像數(shù)據(jù)開(kāi)始，在預(yù)處理（如轉(zhuǎn)換和裁剪等）之后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理（如濾波、配準(zhǔn)和分割等）和分析（如細(xì)胞追蹤等），然后才能得到最終結(jié)果。一些自定義方法（中間行）可以在特定成像實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，并減少后續(xù)處理和分析步驟的負(fù)擔(dān)。最理想的情況是顯微鏡甚至相機(jī)本身可以直接輸出最終結(jié)果，而無(wú)需對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行任何存儲(chǔ)、傳輸和處理（最后一行）。

另一種可能性是智能顯微鏡，它能更進(jìn)一步，不預(yù)先定義ROI，而是讓顯微鏡選擇分別以何種分辨率拍攝哪些區(qū)域。智能顯微鏡這樣的選擇可以基于現(xiàn)有的，或者之前所拍攝的相似樣本的數(shù)據(jù)。

5.2 圖像增強(qiáng)

由于通過(guò)光片顯微鏡采集的圖像數(shù)據(jù)優(yōu)秀的信噪比和整體圖像質(zhì)量，在獲得數(shù)據(jù)后通常不需要進(jìn)行過(guò)多的增強(qiáng)、去噪或恢復(fù)步驟。如有必要，用于共聚焦顯微鏡或?qū)拡?chǎng)顯微鏡所采集圖像數(shù)據(jù)的各種濾波器也可用于光片顯微鏡的圖像數(shù)據(jù)。

5.3 多視圖融合

從多視圖獲取圖像數(shù)據(jù)（見(jiàn)光片技術(shù)小課堂四4.1）之后，一個(gè)必要的處理步驟是多視圖融合。第一步是在空間中相互配準(zhǔn)各個(gè)視圖，這可以通過(guò)基準(zhǔn)標(biāo)記（如熒光珠，見(jiàn)光片技術(shù)小課堂三3.1）、樣本內(nèi)的結(jié)構(gòu)（如熒光核）或采集過(guò)程中相對(duì)位移位置的精確信息來(lái)實(shí)現(xiàn)。一旦配準(zhǔn)，可以通過(guò)平均圖像強(qiáng)度或以基于內(nèi)容的方式來(lái)融合圖像數(shù)據(jù)。多視圖融合的結(jié)果是繼承了每個(gè)視圖最佳特征的單個(gè)數(shù)據(jù)集。最終，使用者們會(huì)希望實(shí)時(shí)執(zhí)行這種多視圖融合，以便只保存最終融合，而不保存任何原始數(shù)據(jù)。

5.4 圖像分析

光片顯微鏡和其他傳統(tǒng)顯微鏡，例如共焦顯微鏡，的圖像分析方法沒(méi)有太大區(qū)別。數(shù)據(jù)集可能需要進(jìn)行三維重構(gòu)，數(shù)據(jù)對(duì)象可能需要進(jìn)行分割和追蹤，可能需要在空間和時(shí)間上測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度，還可能需要分析多個(gè)通道之間的相關(guān)性。對(duì)于共定位研究和熒光定量，必須的注意一點(diǎn)是靠近視野邊緣時(shí)的光片形態(tài)和強(qiáng)度的變化，因?yàn)檫@會(huì)影響照明和熒光激發(fā)。因此，使用者應(yīng)仔細(xì)檢查光片參數(shù)（見(jiàn)光片技術(shù)小課堂四4.2），并使用選定的基準(zhǔn)標(biāo)記驗(yàn)證x、y和z中每個(gè)通道的重疊。

在大多數(shù)情況下，光片顯微鏡所獲取的圖像數(shù)據(jù)與普通光學(xué)顯微鏡的主要區(qū)別通常是數(shù)據(jù)量過(guò)大。光片顯微鏡所獲取的高空間與時(shí)間分辨率的數(shù)據(jù)需要更強(qiáng)大的計(jì)算能力，并且這尤其適用于延時(shí)數(shù)據(jù)的分析。普通的分析工具通常需要將整個(gè)數(shù)據(jù)集加載到內(nèi)存中，而對(duì)于光片顯微鏡的圖像數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)，這通常是不可能的。與普通的光學(xué)顯微鏡實(shí)驗(yàn)相比，使用者必須謹(jǐn)慎考慮所需的分辨率：最高的可能速度、最大的視野和最高的分辨率可能聽(tīng)起來(lái)非常美好，但數(shù)據(jù)量的快速增加也會(huì)使后續(xù)分析變得更加困難。

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