徠卡高壓冷凍在腦片突觸研究中的應(yīng)用

圖1 “閃光冷凍”示意圖

今天為大家介紹一種新穎的、可用于完整的哺乳動物急性腦切片和器官切片培養(yǎng)的快速和冷凍方法，該方法探索了小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經(jīng)元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）的結(jié)構(gòu)和功能，囊泡池的變化。

內(nèi)容摘要

神經(jīng)科學(xué)的主要重點是進一步理解突觸的結(jié)構(gòu)和功能，以及兩者之間的關(guān)系。盡管對突觸傳遞的認(rèn)知有了重要進展，但仍有許多問題沒有得到解答。由于中樞突觸的分子組成、結(jié)構(gòu)和功能高度多樣化，因此對突觸進行精確分析對逾越這些知識鴻溝大有裨益。

電鏡提供了具有納米級別的空間分辨率，然而它有一個很明顯的缺點就是只能捕捉靜態(tài)圖像。為了分析活標(biāo)本中的突觸，通常使用共聚焦、雙光子和超高分辨技術(shù)成像，然而這些技術(shù)經(jīng)常用于離體培養(yǎng)的神經(jīng)元，很難達(dá)到足夠的分辨率來識別單個的激活區(qū)或單個突觸囊泡。因此，想要洞悉中樞突觸的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，需要尋找一項兼顧捕捉納米級空間和毫秒級時間分辨率的技術(shù)。

與以往報道方法不同的是，這種改進的“閃光與冷凍”技術(shù)，可應(yīng)用于急性切片和類器官切片培養(yǎng)。這些優(yōu)勢源于使用了薄的急性切片、改進后的載體幾何結(jié)構(gòu)、恢復(fù)方案及低溫保護和冷凍技術(shù)。

基于這一依據(jù)，這一技術(shù)被應(yīng)用于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經(jīng)元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）。苔蘚纖維突觸具有大突觸末端，形態(tài)超微結(jié)構(gòu)明顯，突觸囊泡數(shù)量多，囊泡直徑變化大，存在致密的核囊泡。從生理學(xué)角度看，該突觸初始釋放概率低、突觸可塑性高。

實驗方法

選擇專用于研究突觸前神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因小鼠，Prox1啟動子靶向這些樣本的齒狀回顆粒細(xì)胞。將pro1-creert2系與Ai32(ChR2(H134R)-EYFP)小鼠雜交，選擇性表達(dá)通道型視紫紅質(zhì)。借助免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀測EYFP在顆粒細(xì)胞中的選擇性表達(dá)。急性切片制備與器官切片培養(yǎng)方式如前所述，使海馬苔蘚纖維保持最佳狀態(tài)，以用于電生理學(xué)和高壓冷凍（HPF）實驗。

首先，對急性切片與器官切片培養(yǎng)中光刺激下的突觸傳導(dǎo)進行了深入的電生理學(xué)特征分析，以確定“閃光冷凍”實驗的最佳參數(shù)，比如脈沖持續(xù)的時間和頻率。為了匹配EM ICE高壓冷凍系統(tǒng)，需注意控制刺激的功率和強度。

圖2 優(yōu)化后的“閃光冷凍”技術(shù)工作流

接下來，借助EM ICE系統(tǒng)進行高壓冷凍和光刺激，使用EM AFS或EM AFS2進行冷凍替代。用杜氏樹脂對切片和器官培養(yǎng)物進行包埋，然后用EM UC7冷凍超薄切片機制成超薄切片。

最后用透射電鏡(TEM)觀察樣品。根據(jù)苔蘚纖維的特性和形態(tài)差異，在海馬CA3區(qū)發(fā)現(xiàn)了苔蘚纖維末端。重點分析對照組和實驗組中活動區(qū)的著位囊泡的數(shù)量和直徑，以及在半活動區(qū)的潛在內(nèi)吞凹陷形成。

實驗結(jié)果

“閃光冷凍”電鏡的拍攝的HPF小鼠急性腦片海馬CA3區(qū)圖像如下：A)低倍鏡圖像顯示青苔狀纖維軸突(綠色箭頭)穿過透明層，CA3錐體神經(jīng)元樹突(藍(lán)色箭頭)穿過青苔狀纖維，少量青苔狀纖維(紅色箭頭)位于這些樹突和軸突之間。B)高倍鏡圖像顯示苔蘚纖維(紅色箭頭)布滿突觸囊泡和苔蘚纖維軸突(綠色箭頭)。優(yōu)化后的實驗體系保留了急性切片最佳超微結(jié)構(gòu)，可媲美無光遺傳學(xué)刺激的HPF類器官腦片的超微結(jié)構(gòu)。

圖3 HPF急性切片的EM圖像

結(jié)果顯示，“未釋放”囊泡池（the docked vesicle pool）和在和“已釋放”囊泡池（the functionally defined readily releasable pool）之間有重疊，即兩種囊泡具有共同的結(jié)構(gòu)和功能部分，這為隨后突觸的快速內(nèi)吞作用提供了證據(jù)。

此外，作者展示了中度刺激后內(nèi)吞的孔狀結(jié)構(gòu)外觀，提供了快速網(wǎng)格蛋白獨立的內(nèi)吞機制的結(jié)構(gòu)證據(jù)。

圖4 結(jié)果示意圖

實驗結(jié)論

這項研究表明了了“閃光冷凍”技術(shù)的廣泛適用性，可用于小鼠海馬組織的急性切片和器官切片培養(yǎng)，也可用于包括小腦和腦干在內(nèi)的多種大腦區(qū)域的急性切片。
總的來說，這一整體升級后的“EM”技術(shù)可用于急性大腦切片突觸傳遞過程中的多個時間節(jié)點的囊泡池變化（結(jié)構(gòu)和功能）機制研究。

高壓冷凍儀 Leica EM ICE

高壓冷凍能夠捕捉精細(xì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動力學(xué)的錯綜變化，結(jié)合光刺激或電刺激的高壓冷凍技術(shù)是您獲得新發(fā)現(xiàn)的平臺。