環(huán)境DNA采樣技術(shù)在生物多樣性研究、入侵物種監(jiān)測等方面的應(yīng)用

一：主要研究內(nèi)容

1、生物多樣性研究：
Thomsen等從丹麥的一個海洋生態(tài)系統(tǒng)中采集海水，利用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)研究海洋魚類生物多樣性。在獲得的環(huán)境DNA中發(fā)現(xiàn)了15種不同的魚類，其中包括一些用傳統(tǒng)監(jiān)測方法很難發(fā)現(xiàn)的稀有物種。同時與9種傳統(tǒng)的海洋魚類調(diào)查方法比較，環(huán)境DNA檢測出的魚類多樣性與其他傳統(tǒng)方法相當(dāng)，甚至優(yōu)于傳統(tǒng)方法。Thomsen等研究表明從湖泊、池塘和河流的少量水樣中直接獲得DNA，可以檢測并定量分析研究區(qū)域內(nèi)珍稀及瀕危淡水動物(兩棲類、魚類、哺乳類、昆蟲類和甲殼類)多樣性。同時表明通過池塘水中分離的DNA，利用第二代測序技術(shù)可以檢測到研究區(qū)域內(nèi)兩棲類和魚類群體，環(huán)境DNA可以作為監(jiān)測珍稀瀕危物種的工具，應(yīng)用于更廣泛的物種監(jiān)測中。

應(yīng)用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)不僅可以針對當(dāng)前的生物多樣性進行有效的評估，也可以對過去的動植物群落的多樣性進行評估。Epp等通過對過去和現(xiàn)在的環(huán)境DNA進行metabarcoding研究，所有目標類群都能通過metabarcoding的方法檢測出來，但是類群之間和不同年代的環(huán)境樣品所檢測的結(jié)果存在較大變異范圍。
目前國內(nèi)在應(yīng)用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)研究生物多樣性的報道還比較少。
 
2、外來入侵物種監(jiān)測：
目前外來入侵物種的情況日趨嚴重。當(dāng)外來物種入侵時，入侵物種很有可能破壞原本的生態(tài)平衡，使生態(tài)系統(tǒng)不完善，從而對本地物種的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響。但是在早期入侵階段外來入侵物種通常數(shù)量不多，使用傳統(tǒng)的檢測方法耗時且效率不高，難度高，不能及時被發(fā)現(xiàn)。這會導(dǎo)致外來入侵物種對本地生態(tài)平衡的危害達到最高值時才受到重視，為時已晚。環(huán)境DNA metabarcoding增強了對入侵物種早期監(jiān)測的可能性，可以有效地遏制物種入侵。

研究發(fā)現(xiàn)利用環(huán)境DNA metabarcoding可以從淡水中提取環(huán)境DNA，檢測出外來入侵物種的存在。Ficetola等最早將環(huán)境DNA metabarcoding應(yīng)用于物種監(jiān)測，他們使用特異性引物擴增短線粒體DNA序列追蹤在受控環(huán)境和自然環(huán)境中一種入侵牛蛙(Rana catesbeiana)的存在，發(fā)現(xiàn)對環(huán)境中低密度的物種，使用metabarcoding技術(shù)仍然可以進行快速有效的物種檢測。這是首次結(jié)合大規(guī)模測序和DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展來進行物種識別，為利用環(huán)境DNA監(jiān)測外來物種提供了新方法和新思路。

Jerde等利用環(huán)境DNA研究美國芝加哥地區(qū)河流中的兩種入侵亞洲鯉科魚(Hypophthalmichthys molitrix和H.nobilis)，發(fā)現(xiàn)使用傳統(tǒng)電氣捕魚法檢測到一條魚需要93人的努力，而環(huán)境DNA metabarcoding方法檢測到目標物種只需要0.174人d。在亞洲鯉科魚種群密度很低的區(qū)域，只有環(huán)境DNA方法能夠檢測到這兩種魚。

可見，環(huán)境DNA metabarcoding方法不僅在時間和資金成本上優(yōu)于傳統(tǒng)監(jiān)測方法，而且可以在種群密度很低的環(huán)境樣本中靈敏地檢測到入侵物種的存在。

Piaggio等捕獲入侵佛羅里達州的半水棲物種緬甸巨蟒(Python bivittatus)，放置于90L的水箱中評估水中環(huán)境DNA的降解速率，結(jié)果表明緬甸巨蟒的DNA在96h以內(nèi)都可以檢測到。在佛羅里達州6個野外地點采集的水樣中，有5個地點的緬甸巨蟒環(huán)境DNA為陽性，這與緬甸巨蟒的野外分布結(jié)果一致。

Takahara等使用環(huán)境DNA方法采集日本海岸以及周圍島嶼的70個水樣對一種入侵藍腮太陽魚(Lepomis macrochirus)進行檢測。利用藍腮太陽魚的特異性引物(100bp的Cyt b片段)擴增水環(huán)境DNA，結(jié)果表明70個池塘中有19個池塘遭受藍腮太陽魚的入侵。盡管魚的大小、習(xí)性等因素對實驗結(jié)果有一定影響，但使用環(huán)境DNA metabacoding提高了監(jiān)測入侵物種的準確度。
 
3、稀有物種保護：
通過水體中的環(huán)境DNA可以有效檢測水生脊椎動物，并且已在濕地和大型河流研究中得到證實。利用環(huán)境DNA檢測河流中的稀有物種和隱秘物種可以增加調(diào)查結(jié)果準確性，減少調(diào)查成本。Goldberg等利用metabarcoding技術(shù)，通過收集快速流動的水體環(huán)境DNA樣本，對尾突角蟾(Ascaphus montanus)和愛達荷陸巨螈(Dicamptodon aterrimus)兩種珍稀物種進行監(jiān)測。設(shè)計特異性引物尾突角蟾和愛達荷陸巨螈的線粒體Cyt b區(qū)域的85bp和78bp片段，在5個不同物種密度的水樣中均成功進行了PCR擴增并靈敏地檢測到了目標物種的存在。該研究還發(fā)現(xiàn)早春季節(jié)比早秋季節(jié)更難以檢測到兩棲類物種存在，推測可能是由于早春比早秋溫度更低，降低了生物代謝速率而導(dǎo)致。

Foote等從海水中分離DNA，使用特異性引物擴增線粒體DNA區(qū)域60—80bp的片段檢測水體中是否存在港灣鼠海豚(Phocoena phocoena)，對控制條件下和自然條件下該物種進行遺傳監(jiān)測。在一個樣地中檢測到長肢領(lǐng)航鯨(Globicephala melas)，而該物種極少在研究海域被發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明環(huán)境DNA的方法可用于檢測稀有物種。

Wilcox等利用環(huán)境DNA結(jié)合定量PCR檢測了河流中的兩個稀有物種，美洲紅點鮭(Salvelinus fontinalis)和強壯紅點鮭(S.confluentus)，同時發(fā)現(xiàn)定量PCR(qPCR)比傳統(tǒng)PCR更加靈敏，檢測概率更高。Rees等利用環(huán)境DNA和傳統(tǒng)的實地調(diào)查方法開展對英國珍稀保護物種冠北螈(Triturus cristatus)的監(jiān)測，野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)有冠北螈分布的地點中，采集的水樣DNA中成功檢測出冠北螈的概率為84%。使用環(huán)境DNA方法監(jiān)測物種，對物種及其生存環(huán)境不會造成損害。隨著測序成本的下降，環(huán)境DNA與metabarcoding技術(shù)結(jié)合應(yīng)用在許多情況下甚至優(yōu)于一些傳統(tǒng)監(jiān)測方法，成為物種監(jiān)測方法的又一選擇。
 
4、一些補充說明：
使用環(huán)境DNA監(jiān)測水生生物時，必須保證能獲得該環(huán)境的完整樣品并能進行很好的保存。水體的溫度和光照情況^，水體的流速，物種密度和在環(huán)境中的停留時間，生物體的發(fā)育階段等均會對環(huán)境中所取的DNA的量造成影響。

Maruyama等對水體中DNA的半衰期進行了研究和計算，發(fā)現(xiàn)魚類離開此水體后環(huán)境DNA的半衰期是6.3h，但對環(huán)境DNA降解速率及其影響因素，環(huán)境DNA在環(huán)境中存在時間的長短等問題仍缺乏充分的了解。

在采集溪流水樣時，由于許多溪流水來自于地下水，所以接觸到目標生物脫落DNA的可能性較低。此外，由于溪流水水位淺而且是充分混合的，因此脫落的DNA被光降解的可能性更大，導(dǎo)致在溪流中檢測到的目標物種密度會比較低。使用環(huán)境DNA metabarcoding技術(shù)對淡水中的物種進行檢測已被證實快速有效。淡水中水流較平和且流量小，所以準確度高。與淡水相比，海洋生態(tài)系統(tǒng)中有單位體積中的生物量比例更大，海流和波浪的影響作用，以及鹽度對保存和提取環(huán)境DNA的影響都需要加以考慮。這些因素可能意味著海水中的環(huán)境DNA不太集中，且分散更迅速，提取DNA時比較困難，導(dǎo)致在海水中使用時只能針對一小片區(qū)域，并且對外來入侵物種的檢測效率不高。因此在海水中的使用還需要進一步的研究與完善。

二：水環(huán)境eDNA采樣設(shè)備

便攜式eDNA采樣器——上海蔚雨科技有限公司

多通道eDNA采樣器——上海蔚雨科技有限公司

設(shè)備優(yōu)勢
 
1、可記錄采樣點流速、GPS、溫度等信息
2、內(nèi)置計算機，可導(dǎo)出采樣日志、為每個樣品標注采樣編碼
3、采樣飽和后具有震動反饋功能，可設(shè)置定量采水
4、具備遠程藍牙遙控采水功能
5、可進行多通道的同步采樣
6、自封濾膜（技術(shù)）：采用合成樹脂材料自動對樣本進行脫水處理，使DNA信息能在室溫下保存90天不降解（傳統(tǒng)采樣方式需要對樣品進行乙醇加注、冷凍、防腐等措施，費時費力，往往會在采樣點浪費大量時間）
①降低污染——傳統(tǒng)樣品處理方式需要現(xiàn)場對樣品進行防腐處理，會增加污染可能。
②提高DNA含量——與傳統(tǒng)使用乙醇相比，檢測到的DNA含量是其2倍。
③提高效率——現(xiàn)場無需準備乙醇及緩慢的過濾工作，無需準備冷凍措施低溫保存樣品，即便是沒有相關(guān)從業(yè)經(jīng)驗的人員即可快速上手實現(xiàn)標準化的采樣工作。
 
設(shè)備標配自封濾膜套裝self-preserving packs——封裝后即可郵寄至我司合作實驗室分析

三：分析流程及結(jié)果

環(huán)境DNA提取——設(shè)計合成引物接頭——PCR擴增產(chǎn)物純化——PCR產(chǎn)物定量均一化——測序文庫構(gòu)建——高通量測序——生成報告

樣品報告包括但不限于：
 
1、物種多樣性統(tǒng)計
2、物種組成分析
3、群落比較分析
4、捕撈數(shù)據(jù)一致性分析