相機(jī)觸發(fā)LED光源實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞自動(dòng)多色成像多方案適用性探討

一.背景

活細(xì)胞多色顯微熒光成像是在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)科研中常用的科研方法。活細(xì)胞培養(yǎng)熒光顯微鏡由于可以進(jìn)行活細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)條件，例如：溫度控制、濕度控制、CO₂ 濃度控制、O₂ 濃度控制，同時(shí)配置高速攝像頭可以進(jìn)行時(shí)間序列（Time-Lapse），結(jié)合多色熒光濾片切換，LED 單波長(zhǎng)光源激發(fā)，可配備相差（Phase Contrast），微分干涉（DIC），熒光等對(duì)照方式可以更加直觀詳細(xì)的進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)記錄而受到廣大科研用戶的認(rèn)可。近年來，倒置熒光顯微鏡配置活細(xì)胞培養(yǎng)裝置的相關(guān)實(shí)驗(yàn)越來越普遍，目前市面上集成的熒光成像系統(tǒng)很多，例如：GE 公司的 DELTAVISION 活細(xì)胞成像系統(tǒng)，ZEISS公司的 CELL OBSERVER 系統(tǒng)，或其它大品牌公司的整套活細(xì)胞成像系統(tǒng)，價(jià)格通常20萬美元以上，且維護(hù)成本高，廠家工程師上門速度通常比較慢或者收費(fèi)貴，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室難以負(fù)擔(dān)。

 
活細(xì)胞多色熒光成像技術(shù)要求：

• 由于活細(xì)胞時(shí)間序列成像時(shí)間長(zhǎng)，通常要24小時(shí)以上，獲取細(xì)胞形態(tài)的時(shí)間序列圖片進(jìn)行分析�；罴�(xì)胞培養(yǎng)箱需要能夠放置在顯微鏡載物臺(tái)上實(shí)時(shí)成像。要求能夠控制精確溫度，濕度，CO2濃度，O2濃度等細(xì)胞培養(yǎng)條件。
• 活細(xì)胞處于快速運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行多色熒光成像時(shí)，需要不同熒光通道進(jìn)行快速切換，傳統(tǒng)的電動(dòng)熒光濾色鏡轉(zhuǎn)盤設(shè)計(jì)的電動(dòng)顯微鏡通常價(jià)格昂貴，設(shè)備復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)需要一種更簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)的解決方案。
• 活細(xì)胞熒光樣品在傳統(tǒng)的熒光光源例如汞燈或者金屬鹵化物光源照射下，光毒性作用導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，而且在曝光時(shí)間過長(zhǎng)容易照成熒光淬滅。

 
二．方案介紹
 
新型的LED光源由于其使用壽命長(zhǎng)，發(fā)熱少，發(fā)射光強(qiáng)恒定且重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)成為越來越多熒光顯微鏡成像的選擇。隨著LED光源亮度加強(qiáng)和譜線增加，LED光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)的汞燈或者金屬氯化物光源已經(jīng)是大勢(shì)所趨。 LED光源除了使用壽命長(zhǎng)之外,還有一個(gè)最重要的優(yōu)點(diǎn)即控制性好。 LED光源可即時(shí)開/關(guān)，精確的強(qiáng)度控制。LED光源還可以接受TTL(晶體管-晶體管邏輯電平)信號(hào)系統(tǒng)控制LED快速波長(zhǎng)切換，允許通過多通熒光濾片進(jìn)行高速多色熒光成像，無震動(dòng)無濾片偏移�；�于此我們搭建的這套系統(tǒng)如下：

通過LED光源切換配合PINKEL濾片組代替熒光濾片轉(zhuǎn)盤切換通道

• 通過相機(jī)BNC端口接受TTL信號(hào)觸發(fā)

• 通過控制面板上的“Sequence Runner”模式設(shè)置LED在接受TTL信號(hào)后運(yùn)行次序。

• 在OCULAR軟件界面設(shè)置相機(jī)曝光觸發(fā)光源，并且設(shè)置曝光時(shí)間。

 

• 在NIB900倒置熒光顯微鏡上加載鏡載活細(xì)胞培養(yǎng)裝置， 通過溫度控制器和氣體控制器還調(diào)節(jié)培養(yǎng)罩里面的溫度，CO2濃度，濕度，O2濃度等培養(yǎng)條件。

由于新型LED光源和相關(guān)相機(jī)聯(lián)用，多通熒光濾片等技術(shù)的成熟，廣州科適特科學(xué)儀器有限公司作為顯微鏡及顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)裝置，熒光光源，攝像頭等配件的供應(yīng)商。有機(jī)會(huì)搭建并且測(cè)試了一種優(yōu)惠簡(jiǎn)便的解決方案。
 
三．測(cè)試過程
 
本測(cè)試過程采用了寧波永新NEXSCOPE NIB900倒置熒光顯微鏡主機(jī)，配置了CoolLED
公司的pE-300ultra高性能LED光源，通過100%側(cè)分光口連接Retiga R1相機(jī)，搭配了德
國(guó)ibidi公司的鏡載活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行活細(xì)胞的培養(yǎng)成像。 主要測(cè)試了以下兩個(gè)方面：

• 通過Retiga R1相機(jī)通過外觸發(fā)pE-300Ultra LED光源，在相機(jī)曝光時(shí)同步打開LED光源，并且利用光源當(dāng)中的”Sequence Runner”順序打開相應(yīng)的LED熒光通道，顯微鏡濾片采用Chroma公司的多通熒光濾片，進(jìn)行紫外和紅色熒光的快速切換成像。通過加載活細(xì)胞培養(yǎng)裝置后，對(duì)樣品進(jìn)行加熱，進(jìn)行熒光測(cè)試。檢測(cè)成像的均一性和熒光強(qiáng)度對(duì)比。圖像均一性和熒光亮度評(píng)估。

左圖：MitoTracker Red成像(25攝氏度)     右圖：加載活細(xì)胞裝置后MitoTracker Red成像  (37攝氏度)
  左圖：無活細(xì)胞裝置DAPI成像(25攝氏度)       右圖：加載活細(xì)胞裝置后DAPI成像(37攝氏度)

• 通過加載活細(xì)胞培養(yǎng)裝置后，對(duì)樣品進(jìn)行加熱，進(jìn)行明場(chǎng)測(cè)試。檢測(cè)成像的均一性和熒光強(qiáng)度對(duì)比。

左圖：無活細(xì)胞裝置明場(chǎng)病理片成像(25攝氏度)  右圖：加載活細(xì)胞裝置后明場(chǎng)病理片成像(37攝氏度) 左圖：無活細(xì)胞裝置明場(chǎng)病理片成像(25攝氏度)  右圖：加載活細(xì)胞裝置后明場(chǎng)病理片成像(37攝氏度)
 
四．分析測(cè)試結(jié)果

• 通過NIB900直接連接pE-300系列LED光源可以獲得良好的熒光強(qiáng)度和圖像均一性。
• 可以通過相機(jī)曝光觸發(fā)實(shí)現(xiàn)光源同步開關(guān)，可以通過曝光時(shí)間控制光源打開時(shí)間，減少樣品過度曝光導(dǎo)致的熒光淬滅。
• 通過LED光源的內(nèi)置Sequence Runner設(shè)置芯片依次曝光的順序，實(shí)現(xiàn)TTL觸發(fā)LED光源通道切換代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光濾片轉(zhuǎn)盤切換。提高切換速度，避免震動(dòng)和濾片漂移問題。
• 鏡載活細(xì)胞可以精確控制活細(xì)胞培養(yǎng)條件，德國(guó)ibidi活細(xì)胞培養(yǎng)裝置放置在NIB 900顯微鏡上可以精確對(duì)焦，不影響明場(chǎng)和熒光顯微成像效果。能夠搭配同時(shí)使用。 

五．測(cè)試配置方案

• 倒置熒光顯微鏡主機(jī)：NEXSCOPE NIB900
• 活細(xì)胞培養(yǎng)裝置：ibidi Heating incubator(德國(guó) ibidi)
• 顯微鏡LED光源：CoolLED pE-300Ultra(英國(guó) CoolLED)
• 攝像頭及軟件：Photometrics Retiga R1帶BNC觸發(fā)線, Ocular V2.0.1(加拿大 Photometrics)
• PINKEL 濾片：Chroma 69401 （美國(guó) Chroma）
• 樣品：invitrogen FLuocells #1 BPAE cells (美國(guó) Invitrogen)

六．總結(jié)

1.搭建的活細(xì)胞培養(yǎng)裝置各部分整合良好，可以比較經(jīng)濟(jì)的方式實(shí)現(xiàn)順暢的活細(xì)胞多色熒光成像。

2.寧波永新NEXSCOPE NIB900具有很高的光學(xué)質(zhì)量，具有DIC，相差，熒光多重功能，配置了三個(gè)攝像接口（100%/0；20%/80%;0:100%）。在成像均勻性，色差還原，物鏡表現(xiàn)，主機(jī)擴(kuò)展性方面表現(xiàn)良好，與進(jìn)口顯微鏡同檔次無明顯差別，屬少見的國(guó)產(chǎn)研究級(jí)顯微鏡精品。

3.相對(duì)常規(guī)的活細(xì)胞成像系統(tǒng)，此方案采用新型LED光源，對(duì)細(xì)胞光毒性較小，適合活細(xì)胞樣品的時(shí)間序列成像。

4.相機(jī)曝光觸發(fā)光源同步開關(guān)，減少非必要的熒光樣品和活細(xì)胞的照射導(dǎo)致的光漂白和光毒性。

5.相對(duì)于常規(guī)的活細(xì)胞成像系統(tǒng)，此方案通過相機(jī)曝光輸出的TTL信號(hào)切換熒光通道。無需濾片轉(zhuǎn)盤切換，減少了顯微鏡震動(dòng)和濾片漂移導(dǎo)致多通道疊加偏差。

6.活細(xì)胞培養(yǎng)裝置中溫度控制是一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，但是由于活細(xì)胞培養(yǎng)的探測(cè)器通常位于培養(yǎng)腔室的上壁邊緣，由于室溫（例如 22℃）與培養(yǎng)箱中設(shè)定溫度（例如 37℃）偏差比較大，溫度傳導(dǎo)散熱效應(yīng)，為了保證真實(shí)培養(yǎng)溫度精確，顯微鏡活細(xì)胞培養(yǎng)在不同的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境首次使用前通常需要進(jìn)行校準(zhǔn)。

7.配件可以單獨(dú)增加或者拆卸，有利于減少實(shí)驗(yàn)預(yù)算，提高顯微鏡和配件的使用效率。

8.此方法采用相機(jī)觸發(fā)LED光源順序開關(guān)LED通道，配合多通熒光濾片可以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)的系統(tǒng)活細(xì)胞多色熒光成像功能。并且可以獲得更好的時(shí)間方便率。切換速度更快，適合活細(xì)胞樣品多重?zé)晒獬上瘛?br /> 9.由于缺乏活細(xì)胞樣品，有些功能比如活細(xì)胞時(shí)間序列，微分干涉觀察，相差成像等此次沒有完成測(cè)試，等有條件后續(xù)進(jìn)行。