構(gòu)建基因敲入細(xì)胞系的原理和需要注意的細(xì)節(jié)

CRISPR-Cas9基因敲入（KI, Knock in）是指將外源性基因通過同源重組（HDR）的方式插入到基因組中，使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的一種基因編輯技術(shù)。KI的外源基因可以是具有蛋白表達(dá)功能的編碼基因，可以是參與基因調(diào)控的DNA元件，也可以是一段沒有功能的DNA序列等。

基因敲入技術(shù)在基因功能研究和疾病治療等眾多方面發(fā)揮著重要的作用，但是在實(shí)際的操作過程中，想獲得一個(gè)純合的KI細(xì)胞系并不是一件容易的事。因?yàn)镵I細(xì)胞系構(gòu)建是否成功是受到多方面因素影響的，如敲入基因片段的長短、同源重組效率、細(xì)胞系類型等均能影響編輯效率，所以這也使得KI的技術(shù)難度很高。今天讓我們了解一下構(gòu)建KI細(xì)胞系的原理和需要注意的細(xì)節(jié)。

CRISPR-Cas9基因敲入原理
在sgRNA引導(dǎo)下，Cas9內(nèi)切酶定點(diǎn)切割DNA雙鏈而產(chǎn)生DNA缺口，然后生物體啟動(dòng)同源重組修復(fù)途徑，當(dāng)存在一段高度同源的DNA模板（Donor DNA）時(shí)，會(huì)以Donor DNA為模板進(jìn)行修復(fù)，從而達(dá)到將目的片段定點(diǎn)引入基因組的目的（圖1）。

圖1. CRISPR-Cas9基因敲入原理

在這個(gè)過程中，Cas9的切割效率、細(xì)胞雙鏈DNA斷裂后以同源重組方式進(jìn)行修復(fù)的概率、以Donor模板重組的概率一同影響最終的基因編輯效率。這也是陽性克隆獲得率低的原因。

構(gòu)建KI細(xì)胞系需要注意的細(xì)節(jié)
KI細(xì)胞系的構(gòu)建流程是先設(shè)計(jì)sgRNA及Donor模版，然后通過核糖核蛋白法（Ribonucleoprotein, RNP）或質(zhì)粒法等方法將sgRNA、Cas9蛋白和Donor模板轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞中。以RNP法為例，將合成的sgRNA、純化后的Cas9蛋白和Donor模板電轉(zhuǎn)進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞中，通過抗性篩選、PCR鑒定及測(cè)序確定KI細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。在這個(gè)過程中，sgRNA的設(shè)計(jì)、Donor模板的設(shè)計(jì)等均會(huì)影響最終的編輯結(jié)果，下面我們總結(jié)了會(huì)影響基因編輯效率的部分原因：

1. sgRNA的設(shè)計(jì)
sgRNA-Cas9在KI基因編輯系統(tǒng)中如“剪刀”一般精準(zhǔn)切開雙鏈DNA，這把“剪刀”鋒利與否和精確度能直接影響KI基因編輯系統(tǒng)的編輯效率。而sgRNA的設(shè)計(jì)就是重要的一步，它能影響目的片段能否精準(zhǔn)插入和切割效率。因此需要綜合多方面因素來科學(xué)設(shè)計(jì)sgRNA。在設(shè)計(jì)時(shí)要綜合考慮候選編輯位點(diǎn)的序列、位置、正負(fù)鏈、GC含量、潛在的脫靶位點(diǎn)等信息�？梢詤⒄找韵略瓌t設(shè)計(jì)sgRNA：

（1） 候選編輯位點(diǎn)的正鏈靶點(diǎn)和負(fù)鏈靶點(diǎn)的切割效率相同，都可以設(shè)計(jì)靶點(diǎn)；

（2） 靶點(diǎn)的GC含量盡量不要低于40%，靶點(diǎn)序列GC含量偏高（50-70%）有較高的打靶效率；

（3） 靶點(diǎn)內(nèi)不要有連續(xù)4個(gè)以上的T堿基，以防成為RNA Pol III的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；

（4） 為了避免或減少非特異脫靶突變，應(yīng)進(jìn)行靶點(diǎn)特異性分析。推薦使用CCTop（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/）在線網(wǎng)頁進(jìn)行預(yù)測(cè)。最后挑選切割效率高、特異性好的一條或多條sgRNA開展實(shí)驗(yàn)。

2. RNP法和質(zhì)粒法的選擇
細(xì)胞內(nèi)存在Cas9蛋白和sgRNA是實(shí)現(xiàn)基因敲入的重要一步。表達(dá)Cas9蛋白和sgRNA的常用方法有核糖核蛋白法（ ribonucleoprotein, RNP ）和質(zhì)粒法等。這兩種方法各有優(yōu)劣，根據(jù)賽業(yè)眾多成功KI案例經(jīng)驗(yàn)，我們更加推薦使用RNP法。質(zhì)粒法流程相對(duì)簡(jiǎn)單，周期較短，成本低，但無法穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白。而RNP法脫靶概率低、無DNA整合風(fēng)險(xiǎn)和啟動(dòng)子兼容性問題，5-6日即可完成切割效率檢測(cè)，顯著縮短實(shí)驗(yàn)周期。在轉(zhuǎn)染12-24h后快速發(fā)生基因編輯，質(zhì)粒載體一般需要72h，因此RNP法比質(zhì)粒表達(dá)載體具有更高的效率。并且不引入多余的表達(dá)元件或因此導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。

3. Donor模板的設(shè)計(jì)
Donor模板對(duì)同源重組的效率具有重要的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中需要考慮以下因素：

（1）插入位點(diǎn)與雙鏈DNA缺口（Double Strand Breaks，DSB）的距離。距離不應(yīng)該超過100 bp，而最理想的距離是在10 bp以內(nèi)。如果超過這個(gè)距離，重組效率會(huì)大大降低。

（2）敲入片段的長度。短片段的敲入（如Tag標(biāo)簽等）可以使用ssODN。長片段的敲入則需要dsDNA質(zhì)粒作為修復(fù)模板，需要注意的是敲入的片段不能過長，一般不超過5 kb（包含抗性和熒光篩選），過長會(huì)降低重組效率。

（3）同源臂的長度。一般而言，加長同源臂能一定程度上提高重組效率。并且插入的片段越大，所需要的同源臂長度越長，而同源臂一般選取約1500 bp較為合適。

（4）同源臂模板的選擇。同源臂建議以待突變的目的細(xì)胞基因組為模板擴(kuò)增，避免不同細(xì)胞基因組差異導(dǎo)致同源臂不同源，降低重組效率。

4. 細(xì)胞類型與生長狀態(tài)
在瞬轉(zhuǎn)之前應(yīng)注意細(xì)胞類型是否合適，如關(guān)注細(xì)胞的增殖速度，增殖太慢的細(xì)胞發(fā)生重組效率也低下。還要保證細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)、處于對(duì)數(shù)生長期、合適的生長密度、無支原體污染等。

5. 瞬轉(zhuǎn)電壓
合適的瞬轉(zhuǎn)電壓能影響編輯效率和細(xì)胞的存活，電壓過低會(huì)影響編輯效率，電壓過高會(huì)使細(xì)胞死亡。因而需要摸索不同細(xì)胞類型的合適瞬轉(zhuǎn)電壓。一般而言，轉(zhuǎn)瞬電壓和細(xì)胞的直徑有關(guān)系，直徑越大電壓越低。建議結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇最佳的瞬轉(zhuǎn)電壓。

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