中國(guó)研究者利用10x單細(xì)胞結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)θ伺咛ジ芜M(jìn)行時(shí)空分析

        肝臟由超過(guò) 20 種細(xì)胞類型組成，包括肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞（膽管細(xì)胞）和各種循環(huán)免疫細(xì)胞等，它們構(gòu)成了肝功能的基礎(chǔ)，包括糖酵解和尿素代謝、免疫反應(yīng)和藥物解毒。肝臟還是重要的造血器官。造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞 (HSPC) 遷移大約在人類第 6 周時(shí)進(jìn)入肝芽，然后，胎兒肝臟成為主要的造血器官，并為 HSPC 增殖和分化提供特定的生態(tài)位。作為重要器官之一，肝臟容易受到體內(nèi)外多種致病因素的影響，引起炎癥和損傷。此外，肝臟具有很強(qiáng)的再生能力，肝部分切除術(shù)后，肝臟再生依賴于殘余肝組織的再生能力，這引起了公眾的廣泛關(guān)注。因此，了解這個(gè)復(fù)雜的器官在胚胎發(fā)生過(guò)程中是如何發(fā)育的，將有助于深入了解如何設(shè)計(jì)功能性肝臟替代組織以及如何促進(jìn)肝臟再生。
       在過(guò)去的十年中，高通量DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展使人們能夠以前所未有的分子分辨率來(lái)研究肝臟的發(fā)育，Bulk RNA 測(cè)序 (RNA-seq) 技術(shù)使得從大塊組織中獲得無(wú)偏的高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)成為可能，但無(wú)法解決細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題，單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 是解決轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的有力工具，這種單細(xì)胞分析的應(yīng)用極大地促進(jìn)了干細(xì)胞特性、細(xì)胞免疫、癌癥診斷和發(fā)育過(guò)程的實(shí)驗(yàn)研究。然而，測(cè)序前的組織解離卻導(dǎo)致細(xì)胞位置信息的丟失，從而限制了我們對(duì)胎兒肝臟發(fā)育中細(xì)胞組織和相互作用的理解，空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以將全轉(zhuǎn)錄組分析融入到帶有形態(tài)背景的完整組織切片上，可對(duì)復(fù)雜的組織樣本進(jìn)行空間基因表達(dá)定位。
      2021年5月20日，來(lái)自中國(guó)廣東省自身免疫工程技術(shù)研究中心臨床醫(yī)學(xué)研究中心等的研究人員在Frontiers in Cell and Developmental Biology上在線發(fā)表了題為“Integrating Spatial Transcriptomics and Single-Cell RNA-seq Reveals the Gene Expression Profling of the Human Embryonic Liver”的文章，該文結(jié)合10x Genomics高通量的scRNA-seq和Visium空間基因表達(dá)解決方案的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，對(duì)人類受孕后 8 周 ( 8 PCW) 和 17 周（17 PCW）的胎兒肝臟進(jìn)行了無(wú)偏性分析，系統(tǒng)地鑒定了九種細(xì)胞類型，并定義了主要細(xì)胞類型的發(fā)育途徑。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)研究期間，人胎肝經(jīng)歷了血液快速生長(zhǎng)和遷移，并鑒定了紅細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)基因和代謝變化。此外，研究人員還關(guān)注了肝病相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與肝病相關(guān)的17個(gè)基因主要在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在其他細(xì)胞類型中幾乎沒(méi)有表達(dá)�？傊�，這項(xiàng)研究全面、清晰地揭示了人胎兒肝臟各主要細(xì)胞類型的分化過(guò)程，為肝臟疾病的治療和肝臟再生提供了重要的參考數(shù)據(jù)和信息。

ST和scRNA-seq數(shù)據(jù)鑒定人胎兒肝臟中的主要細(xì)胞類型

       為了研究胎兒肝臟中免疫細(xì)胞和紅細(xì)胞的發(fā)育，研究人員使用 10x Genomics Visium空間基因表達(dá)解決方案剖析了人類肝臟發(fā)育過(guò)程中的空間基因表達(dá)動(dòng)態(tài)。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（8 PCW 和 17 PCW）收集胚胎肝臟，通過(guò)H&E染色明場(chǎng)成像獲得形態(tài)背景信息、組織透化、cDNA合成擴(kuò)增、構(gòu)建ST文庫(kù)后測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后，在 8 PCW肝臟中檢測(cè)到 1,267 個(gè)高質(zhì)量spot，平均每個(gè)spot包含 204,628 個(gè)干凈讀數(shù)、1,132 個(gè)基因和 5,924 個(gè) UMI。在17 PCW肝臟中檢測(cè)到3,489 個(gè)spot，每個(gè)spot平均有 78,576 個(gè)讀數(shù)、8,829 個(gè) UMI 和 2,266 個(gè)基因。
       為了進(jìn)行基因表達(dá)異質(zhì)性分析，研究人員對(duì)這兩種人類胚胎肝臟組織進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。通過(guò)對(duì)scRNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和均一化后，分別得到了25,186 個(gè)細(xì)胞和 9,153 個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞分別有 9,239 和 11,248 個(gè)獨(dú)特的 UMI 以及 2,454 和 2,705 個(gè)特異性表達(dá)的基因。為了探究肝臟的細(xì)胞組成，研究者處理了單細(xì)胞數(shù)據(jù)，分別確定了 8 PCW和 17 PCW肝臟中的 31 種和 25 種細(xì)胞狀態(tài)，并根據(jù)文獻(xiàn)中已知的標(biāo)記基因進(jìn)行注釋。

scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)的 MIA整合

       為了整合 scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)，研究者使用了MIA(Multimodal intersection analysis)方法。首先描述組織區(qū)域特異性和細(xì)胞類型特異性基因，然后確定它們的重疊是否低于或高于偶然的預(yù)期，確定了在每個(gè)空間區(qū)域（或每個(gè)細(xì)胞類型）中相對(duì)于其他區(qū)域具有顯著更高表達(dá)的基因。接下來(lái)計(jì)算每對(duì)區(qū)域特異性和細(xì)胞類型特異性基因組之間的重疊，并通過(guò)超幾何測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞的高表達(dá)基因在ST和scRNA-seq數(shù)據(jù)之間顯著重疊。8 PCW肝臟由庫(kù)普弗、中期成紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、晚期成紅細(xì)胞、早期成紅細(xì)胞組成，17 PCW肝臟由肝細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、早期成紅細(xì)胞、中期成紅細(xì)胞、晚期成紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞組成。

       此外，研究者選擇每種細(xì)胞類型中最獨(dú)特的特征基因之一，并以點(diǎn)圖形式呈現(xiàn)以比較差異。Monocle用于根據(jù)轉(zhuǎn)錄相似性以預(yù)測(cè)的發(fā)育軌跡（偽時(shí)間）分析細(xì)胞，結(jié)果產(chǎn)生了一個(gè)緊密連接的分化軌跡，分為兩個(gè)主要分支，對(duì)應(yīng)于不同的時(shí)期 8 PCW和17 PCW。

人類胎兒肝細(xì)胞的空間異質(zhì)性

       研究人員觀察到三個(gè)不同的肝細(xì)胞群(1、3、4)沿17 PCW肝臟的空間深度分布，還描述了Cluster 1-3-4細(xì)胞之間的細(xì)胞通信，為未來(lái)的研究提供了潛在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信息。值得注意的是，盡管Cluster 3和Cluster 1的聯(lián)系更緊密，但事實(shí)是Cluster 3與Cluster 4細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)比Cluster 1更顯著，。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)了一些共享的和活躍的配體受體對(duì)，如DLK1-NOTCH2, EFNA1-EPHA2, AGT-AGTR1，這些配體受體對(duì)在Cluster1與Cluster 4之間以及Cluster3與Cluster4之間的細(xì)胞通信中都存在。

       在17 PCW肝臟的scRNA-seq數(shù)據(jù)中，肝細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為三個(gè)群，然后對(duì)聚類間的差異基因進(jìn)行了鑒定。Heatmap顯示了每種聚類的前10個(gè)標(biāo)記基因。最近，在肝臟發(fā)育早期的肝母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了LGR5+干細(xì)胞和祖細(xì)胞。研究者檢測(cè)了LGR5的表達(dá)模式，并根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了一小部分LGR5+肝母細(xì)胞。在PCW 8時(shí)，5.68%的肝母細(xì)胞表達(dá)slgr5，而在PCW 17時(shí)，LGR5+細(xì)胞的比例下降至3.80%。此外，在8 PCW和17 PCW處存在HNF4A+ID3+肝母細(xì)胞亞群。

紅細(xì)胞系在胎肝中的分化和成熟途徑

       在8 PCW肝臟中，小團(tuán)紅細(xì)胞分散在肝臟各處。在17 PCW肝臟中，肝臟充滿了紅細(xì)胞并完全變紅。值得注意的是，早期成紅細(xì)胞位于肝組織的外圍，中期成紅細(xì)胞和晚期成紅細(xì)胞分散在肝組織的中心區(qū)域。這種戲劇性的形態(tài)變化表明，在實(shí)驗(yàn)研究期間，人類胎兒肝臟經(jīng)歷了血液的快速生長(zhǎng)和遷移，8 PCW和17 PCW均有早期、中期、晚期成紅細(xì)胞。為了研究紅細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，研究者分析了這三種類型紅細(xì)胞之間的基因差異表達(dá)。

        此外，對(duì)紅細(xì)胞的分化軌跡進(jìn)行分析，得到了一個(gè)緊密相連的分化軌跡，分化為五個(gè)主要分支。這表明系統(tǒng)是通過(guò)一個(gè)連續(xù)的血統(tǒng)而不是幾個(gè)不相連的血統(tǒng)來(lái)維持的。此外，在8 PCW和17 PCW肝臟的早期、中期和晚期成紅細(xì)胞中分別鑒定出617、674和503個(gè)DEGs。為了進(jìn)一步了解8 PCW肝臟和17 PCW肝臟紅細(xì)胞的差異，研究者對(duì)兩個(gè)胚胎期的基因表達(dá)模式進(jìn)行了PCA分析。從每個(gè)細(xì)胞類型中選取50個(gè)點(diǎn)，生成均衡的數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)8 PCW和17 PCW肝臟的所有點(diǎn)都可以根據(jù)轉(zhuǎn)錄相似性進(jìn)行區(qū)分。

肝臟疾病相關(guān)基因在胎兒肝組織中的表達(dá)模式

       為了鑒定與胎兒肝臟起源相關(guān)的基因，研究者將胎兒肝臟ST數(shù)據(jù)與一個(gè)公開(kāi)的網(wǎng)絡(luò)資源整合，以可視化地探索與肝臟疾病相關(guān)的細(xì)胞類型和空間位置信息。發(fā)現(xiàn)17個(gè)與肝臟疾病相關(guān)的基因主要在巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在其他細(xì)胞類型中幾乎不表達(dá)。此外，對(duì)這17個(gè)肝病相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示，TGFB1、COL1A1、SPP1、PECAM1、THBS1在表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，而PDE5A與其他基因無(wú)互作。

胚胎肝發(fā)育基因的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

       為了更好地理解肝臟發(fā)育相關(guān)的基因調(diào)控變化和細(xì)胞類型之間的相互作用，研究者使用WGCNA算法基于主要細(xì)胞群中差異表達(dá)的基因構(gòu)建了ST數(shù)據(jù)的無(wú)偏共表達(dá)分析。在8 PCW肝臟中鑒定了5個(gè)主要的共表達(dá)模塊，在17 PCW肝臟中定義了2個(gè)基因表達(dá)模塊。對(duì)這些模塊的研究表明，許多模塊由在特定細(xì)胞群中優(yōu)先表達(dá)的基因組成。此外，高相關(guān)模塊往往包含豐富的KEGG通路、GO生物過(guò)程和蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步突出了基因功能中的協(xié)作模式。此外，細(xì)胞群(或細(xì)胞類型)之間的細(xì)胞通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控是胎兒肝臟發(fā)育的最早過(guò)程。為了研究胎兒肝臟中的細(xì)胞通信和空間交流，研究者進(jìn)行了配體-受體相互作用分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群之間存在活躍的細(xì)胞通信。

胎兒肝細(xì)胞的細(xì)胞周期階段分析

       利用CellCycleScoring算法，研究人員鑒定了胎兒肝細(xì)胞的細(xì)胞周期階段，發(fā)現(xiàn)17 PCW肝臟中增殖肝細(xì)胞(S期和G2/M期細(xì)胞)的比例(~ 57.95%)高于8 PCW肝臟中增殖肝細(xì)胞的比例(~ 21.76%)，這種現(xiàn)象也存在于紅細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中，從8 PCW 的早期59.38%，中期57.04%，后期 62.50%增加到17 PCW的前期 70.14%，中期73.33%，晚期76.94%。因此，在ST數(shù)據(jù)中，肝細(xì)胞和紅細(xì)胞的增殖率在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均有所增加。

總 結(jié)

       胎兒肝臟的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括遷移、分化和許多來(lái)源于中胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞系間的相互作用，而我們對(duì)人類胎兒肝在子宮內(nèi)的發(fā)育知之甚少。
       在這項(xiàng)研究中，研究者鑒定了不同的細(xì)胞狀態(tài)、亞群和胎兒肝組織中的細(xì)胞類型。首先通過(guò)scRNA-seq對(duì)肝臟組織中存在的細(xì)胞群和細(xì)胞類型進(jìn)行表征，同時(shí)，通過(guò)ST對(duì)轉(zhuǎn)錄組區(qū)域進(jìn)行鑒定。通過(guò)MIA將ST數(shù)據(jù)和scRNA-seq數(shù)據(jù)整合在一起，并對(duì)感興趣區(qū)域的數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)偏性分析，繪制了胎兒肝組織中不同細(xì)胞類型和亞群的位置(8 PCW肝臟中有2個(gè)不同的中期紅細(xì)胞群，17 PCW肝臟中有3個(gè)肝細(xì)胞群和2個(gè)巨核細(xì)胞群)，以及細(xì)胞類型之間的關(guān)系。在ST和scRNA-seq數(shù)據(jù)中鑒定了三個(gè)肝細(xì)胞亞群，每個(gè)亞群顯示了不同的基因表達(dá)和功能富集，說(shuō)明不同區(qū)域的肝細(xì)胞可能具有不同的功能。
       在實(shí)驗(yàn)研究期間，人胎兒肝臟經(jīng)歷了血液的快速生長(zhǎng)和遷移。在早-中晚期分化過(guò)程中，大量基因逐漸上調(diào)或下調(diào)。在ST數(shù)據(jù)中，肝細(xì)胞和紅細(xì)胞的增殖率在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中增加。
       此外，研究者還關(guān)注了肝臟疾病相關(guān)基因在胚胎肝中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有17個(gè)已發(fā)表并與肝臟疾病相關(guān)的基因主要表達(dá)于巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在其他細(xì)胞類型中幾乎不表達(dá)。肝星狀細(xì)胞(HSCs)中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-b1 (TGF-b1)信號(hào)通路通過(guò)啟動(dòng)HSCs的促纖維化信號(hào)通路和膠原合成在肝纖維化中起著至關(guān)重要的作用，但TGFb1的來(lái)源尚不清楚，而這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了巨核細(xì)胞富含TGF-b1。在急性肝損傷期間，阻斷巨核細(xì)胞和TGF-b1活化是否可以預(yù)防肝纖維化，還需要進(jìn)一步的研究。嗜肝病毒(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等)通常通過(guò)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)構(gòu)建的保護(hù)性過(guò)濾器進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)，LSECs可組成性地表達(dá)大量的抗炎細(xì)胞因子(如TGF-β)、共刺激分子等，使肝臟免疫平衡向耐受方向轉(zhuǎn)變。由于許多慢性肝炎患者常發(fā)生肝纖維化，因此了解lsec在肝病發(fā)展過(guò)程中的變化和功能至關(guān)重要，lsec在肝臟疾病的臨床診斷和新的靶向治療領(lǐng)域具有良好的前景。
       綜上所述，將scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，能夠整合單細(xì)胞和空間位置信息，并清晰全面地了解人類胎兒肝臟中所有細(xì)胞類型的分化過(guò)程，可為進(jìn)一步研究免疫和感染性肝病的致病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供參考。

參考文獻(xiàn)：

Hou X, Yang Y, Li P, Zeng Z,Hu W, Zhe R, Liu X, Tang D, Ou Mand Dai Y (2021) Integrating Spatial Transcriptomics and Single-Cell RNA-seq Reveals the Gene Expression Profling of the Human Embryonic Liver. Front. Cell Dev. Biol. 9:652408.doi: 10.3389/fcell.2021.652408.