代謝組學(xué)和16S rRNA測序技術(shù)揭示不同膽管炎差異

IgG4相關(guān)硬化性膽管炎(IgG4-SC)與原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)有多種臨床相似之處，但皮質(zhì)類固醇治療對大多數(shù) IgG4-SC 患者有效，而對 PSC 患者存在無效性，且兩種疾病的預(yù)后也不同，PSC發(fā)生肝硬化、膽管癌和結(jié)直腸癌的風(fēng)險高于IgG4-SC。這兩種硬化性膽管炎的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。雖然在PSC中腸道菌群失調(diào)已被廣泛研究，但腸道菌群在IgG4-SC中的作用機(jī)制仍不清楚。來自上海交通大學(xué)唐茹琦/馬雄等團(tuán)隊通過對IgG4-SC、PSC 和健康對照隊列的糞便樣本進(jìn)行代謝組學(xué)和16S rRNA測序等技術(shù)揭示了IgG4-SC和PSC具有不同的宿主-菌群相互作用，且推測與疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，并進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了IgG4-SC有別于PSC的獨(dú)特性，相關(guān)研究成果發(fā)表于《Gut》。

IgG4相關(guān)硬化性膽管炎 (IgG4-SC)是IgG4相關(guān)疾病 (IgG4-RD)的肝膽表型，是一種多系統(tǒng)纖維炎性疾病，表現(xiàn)為血清IgG4水平升高和淋巴漿細(xì)胞浸潤，并伴有大量 IgG4 陽性細(xì)胞。原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC) 是一種進(jìn)行性慢性肝病，其特征是多灶性膽道狹窄和炎癥性腸病 (IBD) 的合并癥。IgG4-SC、黃疸和瘙癢的主要臨床表現(xiàn)與 PSC 相似，因此在某些情況下具有誤導(dǎo)性。

一. IgG4-SC和PSC中的腸道菌群改變

納入135名受試者，其中IgG4-SC (n=34)、PSC (n=37) 和健康對照 (n=64)，對其糞便樣本進(jìn)行了 16S rRNA測序。Simpson指數(shù)分析結(jié)果顯示，與HC組相比，IgG4-SC和PSC中的α-多樣性降低。PCoA（主坐標(biāo)軸分析）結(jié)果顯示，兩個疾病組整體菌群結(jié)構(gòu)均明顯偏離HC組，然而，IgG4-SC和PSC之間無顯著差異（圖 1）。

圖1. IgG4-SC 和 PSC 中的腸道菌群差異

比較 IgG4-SC 與 HC、PSC 與 HC、 IgG4-SC 與 PSC 之間的相對豐度來評估單個屬與 IgG4-SC 或 PSC 的關(guān)聯(lián)。在 IgG4-SC 與 HC 比較組中，經(jīng)混雜因素校正后有17個屬存在顯著差異，包括Streptococcus升高和Lachnospiraceae ND3007、Blautia降低。在 PSC與 HC比較組中，經(jīng)混雜因素校正后有13個屬存在顯著差異，包括Ruminococcus gnavus和 Turicibacter 升高，Oscillospiraceae UCG-005、Lachnospiraceae UCG-010 和 Eubacterium eligens 等降低。在 IgG4-SC 和 PSC 比較組間差異較小，經(jīng)混雜因素校正后無差異。與 HC 相比，IgG4-SC 和 PSC 組菌群變化表現(xiàn)出大量重疊，包括Fusobacterium、Lactobacillus 、Veillonella升高，Oscillospiraceae UCG−002 、Faecalibacterium降低（圖 2）。

圖2. IgG4-SC和PSC患者的腸道菌群特征

二. IgG4-SC和PSC中的代謝組學(xué)改變

考慮到腸道菌群和宿主代謝之間的相互作用，隨后對113個樣本子集的糞便樣本進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，其中IgG4-SC（n=31）、PSC（n=37）和健康對照（n=45)，并對每個注釋到的代謝物（n = 654）與IgG4-SC和PSC的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，校正包括抗生素和UDCA 使用在內(nèi)的混雜因素后，與 HC 相比，IgG4-SC中有58種代謝物存在顯著差異，PSC 中有98種代謝物存在顯著差異。其中31種代謝物在 IgG4-SC和 PSC中發(fā)生一致改變。其中，琥珀酸在兩種疾病中均顯著增加。琥珀酸信號的改變與免疫細(xì)胞的激活和效應(yīng)器功能有關(guān)，菌群產(chǎn)生的琥珀酸在腸道炎癥中的作用已有詳細(xì)報道。L-棕櫚酰肉堿（長鏈�；�肉堿）也在疾病組中顯著富集。先前的研究表明長鏈酰基肉堿可能對炎癥激活產(chǎn)生影響。此外，菌群衍生的氨基酸衍生物，包括γ-氨基丁酸 (GABA)和苯乙胺在IgG4-SC和PSC也被上調(diào)。

在IgG4-SC中唯一改變的27種代謝物中，有23個代謝物在疾病組中增加，包括幾種潛在的促炎介質(zhì)，例如十四酸乙酯（一種長鏈酯）和多不飽和脂肪酸，包括二十二碳五烯酸 (22 n-3)、8,11,14-二十碳三烯酸和花生四烯酸。羥基異己酸、鞘氨醇也在 IgG4-SC 中升高。其中，羥基異己酸是宿主亮氨酸代謝的終產(chǎn)物，具有廣譜殺菌活性；鞘氨醇是神經(jīng)酰胺的前體，參與和細(xì)胞信號傳導(dǎo)密切相關(guān)的鞘脂代謝。

共鑒定出67種代謝物僅在PSC中發(fā)生變化。與 IgG4-SC相比，大多數(shù)代謝物 (n=49, 73%) 在疾病組中表現(xiàn)出較低的水平。由腸道菌群代謝的次級膽汁酸，包括脫氧膽酸 (DCA)、石膽酸 (LCA) 和甘氨酸結(jié)合石膽酸 (GLCA)，在 PSC中顯著降低。SCFA 中的戊酸在PSC中也降低，最近研究表明戊酸誘導(dǎo)Breg分化并抑制 Th17 細(xì)胞，從而預(yù)防結(jié)腸炎和多發(fā)性硬化癥。此外，與IgG4-SC的變化相比，PSC中的中鏈脂肪酸 (MCFA)（包括壬二酸、十一烷酸和十二烷二酸）的降低更為顯著，MCFA 具有多種作用，包括抗真菌和抗炎作用。相反，PSC 中多種氨基酸及其衍生物升高（圖3）。

圖3. PSC和IgG4-SC組與 HC 的糞便代謝組差異

三. 疾病相關(guān)菌群與代謝物之間的關(guān)聯(lián)

糞便代謝組學(xué)和腸道微生物特征在所有受試者中都具有很強(qiáng)的相關(guān)性，證實了糞便微生物和糞便代謝物之間的密切聯(lián)系。隨后，差異菌屬和差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，同時調(diào)整整個隊列中的協(xié)變量。結(jié)果顯示，在對照組中增加的菌屬和代謝物之間呈顯著正相關(guān)，而對照組中富集的菌屬與疾病組中升高的代謝物之間則呈負(fù)相關(guān)，比如，L-棕櫚酰肉堿在兩個疾病組中均升高，與對照組中富集的屬（例如Eubacterium coprostanoligenes和Lachnospiraceae NK4A136）呈負(fù)相關(guān)。在IgG4-SC組觀察到富集的鏈球菌與增加的羥基異己酸呈正相關(guān)。而在IgG4-SC 組降低的菌Blautia，與在兩種疾病中都顯著升高的琥珀酸呈負(fù)相關(guān)。在 PSC中戊酸和 MCFA（壬二酸和十一烷酸）的水平降低伴隨著對照富集屬的豐度降低。此外，LCA與PSC中減少的菌群（Eubacterium eligens、Eubacterium hallii 和 Eubacterium coprostanoligenes）呈正相關(guān)。已報道Eubacterium參與次級膽汁酸的代謝。

圖4. 疾病相關(guān)菌群和代謝物的關(guān)聯(lián)

四. 菌群和代謝物與臨床表型之間的關(guān)聯(lián)

使用偏相關(guān)分析探究菌群和代謝物與臨床參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，在 IgG4-SC 中，差異菌群和代謝物表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)氨酶水平的更多關(guān)聯(lián)。Blautia 與谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；然而，經(jīng)過多次檢測校正后許多關(guān)聯(lián)并不顯著。較高水平的琥珀酸與ALT和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)均呈顯著正相關(guān)；Blautia 的降低和琥珀酸的升高可能是 IgG4-SC 中肝臟炎癥的基礎(chǔ)。而且在PSC中確定了微生物、代謝物和宿主表型之間的新關(guān)系。PSC中改變的許多代謝特征與膽汁淤積有關(guān)，如PSC中降低的次級膽汁酸DCA與堿性磷酸酶 (ALP)和 TB 呈顯著負(fù)相關(guān)（圖 5）。

圖5. 宿主-菌群相互作用的整體關(guān)聯(lián)

五. 隨機(jī)森林建模

建立基于菌群或代謝物的隨機(jī)森林模型來區(qū)分IgG4-SC、PSC和HC，以探究腸道菌群和代謝物在疾病預(yù)測中的潛在作用。采用五折交叉驗證的隨機(jī)森林模型來選擇關(guān)鍵的菌群或代謝物，該方法鑒定了由10個屬組成的菌群特征，該特征將IgG4-SC與HC區(qū)分開來，AUC為 0.81；基于7個代謝物的模型表現(xiàn)優(yōu)于菌群模型，AUC為0.94；且代謝物和菌群的組合模型的AUC也是0.94。同樣，代謝物模型在區(qū)分PSC和HC方面也比基于菌群的模型更準(zhǔn)確（AUC：分別為0.99和0.85）。使用代謝物模型或菌群和代謝物組合模型在區(qū)分IgG4-SC和PSC方面表現(xiàn)出相似的效果（AUC：分別為0.82和0.80），而僅用菌群獲得的模型效果最差（AUC：0.64）�？傊�，這些數(shù)據(jù)表明基于糞便代謝物的預(yù)測模型在區(qū)分疾病狀態(tài)方面比基于菌群的預(yù)測模型表現(xiàn)更好。

圖6 基于菌群或代謝物的隨機(jī)森林模型ROC

小結(jié)

本研究對IgG4-SC、PSC和健康對照組的腸道菌群、代謝組和宿主表型進(jìn)行了綜合多組學(xué)分析。整合分析揭示了 IgG4-SC 和 PSC 中存在不同的宿主-菌群互作。在IgG4-SC患者中，差異菌群和代謝物與轉(zhuǎn)氨酶顯著相關(guān)。Blautia 的顯著降低和琥珀酸的顯著升高可能是 IgG4-SC 中肝臟炎癥的基礎(chǔ)。相比之下，在 PSC 中，菌群和代謝特征的改變與膽汁淤積表型相關(guān)，尤其是Eubacterium和菌群代謝物（包括次級膽汁酸）在PSC中均顯著降低。而且，基于代謝物的預(yù)測模型在區(qū)分疾病狀態(tài)方面比基于菌群的預(yù)測模型更有效。該研究揭示了兩種疾病在宿主-微生物互作中的相似和不同之處，為深入探索發(fā)病機(jī)理提供了新線索。

參考文獻(xiàn)

Qiaoyan Liu, et al. Altered faecal microbiome and metabolome in IgG4-related sclerosing cholangitis and primary sclerosing cholangitis. GUT. 2021. https://doi.org/ 10.1136/gutjnl-2020-323565.

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