Nature文獻(xiàn)解讀：腸道菌群結(jié)構(gòu)和膽汁酸譜與壽命的關(guān)系研究

長(zhǎng)期以來(lái)，微生物組通過其在免疫力和抵抗病原體感染等方面的作用，被認(rèn)為是決定老年人健康狀況的關(guān)鍵因素。老年人體內(nèi)的微生物群落通常表現(xiàn)出個(gè)體差異的增加和多樣性的減少，因此與免疫衰老、慢性全身炎癥和虛弱有關(guān)。而百歲老人（100 歲及以上）卻不太容易患上與年齡相關(guān)的慢性病，推測(cè)百歲老人腸道微生物群中存在特有的成員，能促進(jìn)對(duì)病原體感染和其他環(huán)境壓力的抵抗力。日本慶應(yīng)義塾大學(xué)Yuko Sato團(tuán)隊(duì)展示了百歲老人獨(dú)特的腸道微生物群，富含能夠產(chǎn)生獨(dú)特的次級(jí)膽汁酸 (如Isoallo-LCA) 的微生物，這些次級(jí)膽汁酸代謝能夠抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)造成直接影響。相關(guān)成果發(fā)表于《Nature》。
 

百歲老人的腸道菌群特征

招募一個(gè)由三個(gè)年齡段組組成的隊(duì)列：百歲老人（平均107歲，n = 160）、老年人（85-89 歲，n=112）和年輕人（21-55歲，n=47）。臨床數(shù)據(jù)表明大多數(shù)百歲老人沒有肥胖、糖尿病、高血壓和癌癥等慢性病，與老年人組相比，這些疾病的患病率無(wú)顯著增加。收集三組糞便樣本并表征其微生物組（不包括3名百歲老人和1名接受抗生素治療的老年人）。主坐標(biāo)軸分析（PCoA）顯示百歲老人和兩個(gè)對(duì)照組之間的菌群組成存在顯著差異。其中一些類群在百歲老人組和對(duì)照組中顯示出不同的豐度。Alistipes、Parabacteroides、Bacteroides、Clostridium和 Methanobrevibacter在百歲老人中顯著富集，其中Clostridium scindens具有7α-脫羥基功能，可以將初級(jí)BAs轉(zhuǎn)化為次級(jí)BAs。
 

百歲老人獨(dú)特的膽汁酸特征

宏基因組分析結(jié)果顯示，百歲老人組中，誘導(dǎo)膽汁酸（bai）操縱子基因的相對(duì)豐度增加，隨后對(duì)糞便膽汁酸的分析結(jié)果顯示，各組的總膽汁酸負(fù)荷無(wú)顯著差異，但百歲老人表現(xiàn)出其獨(dú)特的分布，包括初級(jí)BAs水平較低，鵝去氧膽酸 (CDCA) 代謝物水平升高，且異石膽酸（isoLCA）、3-oxoLCA、alloLCA、3-oxoalloLCA和isoalloLCA的水平在百歲老人組中顯著升高，而在老年人組和年輕對(duì)照組中則相對(duì)較低。此外，糞便pH值與這些BAs的濃度呈正相關(guān)，腸道環(huán)境可能會(huì)促進(jìn)某些菌群的繁殖和/或參與這些BA合成酶的表達(dá)和活性。
 

圖1. 百歲老人的糞便 isoLCA、3-oxoLCA、alloLCA、3-oxoalloLCA 和 isoalloLCA 顯著升高
 

產(chǎn)生isoLCA-、3-oxoLCA-、3-oxoalloLCA-和isoalloLCA-細(xì)菌菌株的鑒定

有研究指出E.lenta和Ruminococcus gnavus可通過3α-羥基類固醇脫氫酶(3αHSDH)和3βHSDH分別催化DCA和3-oxoDCA生成3-oxoDCA和isoDCA 。因此，推測(cè)3-oxoLCA和isoLCA以類似的方式通過5BR、3αHSDH和3βHSDH的作用產(chǎn)生。另外，3-oxoallo-、allo- 和isoallo-LCA生成的合成途徑此前尚未確定。推測(cè)3-oxoalloLCA可能是由3-oxo-Δ4-LCA通過5α-還原酶(5AR)同源物生成的。而3-oxoalloLCA轉(zhuǎn)化為alloLCA或isoalloLCA可能分別使用3αHSDH或3βHSDH，這與之前描述的3-oxoDCA轉(zhuǎn)化為DCA或isoDCA的過程相一致。
 

隨后對(duì)一名富含這些次級(jí)膽汁酸的百歲老人（CE91，超過110歲）糞便樣本進(jìn)行培養(yǎng)，并分離出68株獨(dú)特的菌株，這些菌株概括了CE91的菌群結(jié)構(gòu)。然后，分別用CDCA、LCA 或3-oxo-Δ4-LCA作為起始底物培養(yǎng)單個(gè)分離物。結(jié)果顯示，與CDCA共培養(yǎng)不會(huì)導(dǎo)致任何培養(yǎng)物中產(chǎn)生目標(biāo)BAs，而與LCA或3-oxo-Δ4-LCA共培養(yǎng)后，在68株菌株中分別有12株具有產(chǎn)生3-oxoLCA的能力和8株具有產(chǎn)生isoLCA的能力，表明這些菌株具有3αHSDH、3βHSDH和/或5BR活性。而且，與3-oxo-Δ4-LCA共培養(yǎng)后，在Parabacteroides merdae St3、Odoribacter Laneus St19、Odoribacteraceae spp.St21-24以及較低程度的Bacteroides dorei St6-7的培養(yǎng)物中觀察到isoalloLCA的顯著積累，表明這些菌株同時(shí)具有5AR 和3βHSDH酶活性。此外，P. goldsteinii St1-2、Bacteroides thetaiotaomicron St9、B.uniformis St10-13、Alistipes finegoldii St15-16、A. onderdonkii St17-18和O. Laneus St20 培養(yǎng)物都顯示出3-oxoalloLCA的顯著富集，但isoalloLCA的水平卻很低或沒有，可能是由于在這些培養(yǎng)條件下攜帶5AR但3βHSDH的活性缺乏或不足。共發(fā)現(xiàn)20個(gè)擬桿菌屬菌株能夠?qū)?3-oxo-Δ4-LCA轉(zhuǎn)化為3-oxoalloLCA，其中8個(gè)能夠產(chǎn)生isoalloLCA。AlloLCA始終低于檢測(cè)限，表明攜帶5AR的分離株在測(cè)試培養(yǎng)條件下 3αHSDH的活性缺乏或不足。
 

5AR-和3βHSDH介導(dǎo)3-oxo-Δ4-LCA向isoalloLCA的轉(zhuǎn)化

對(duì)68個(gè)分離株進(jìn)行基因組測(cè)序分析，鑒定到21個(gè)擬桿菌屬中存在與人5AR (SRD5A1) 直系同源的序列，氨基酸序列相似性＞30% 。在21個(gè)菌株中，發(fā)現(xiàn)與膽汁酸代謝功能相關(guān)的基因簇，包括注釋為NADH：黃素氧化還原酶的序列，預(yù)測(cè)為5BR。還鑒定到注釋為短鏈脫氫酶 (SDR)的序列，預(yù)測(cè)其為3βHSDH。其中3βHSDH序列包括兩組：I組序列 (3βHSDH-I)與P. merdae St3 3βHSDH顯示出高度相似性 (>40%)，而II組序列 (3βHSDH-II) 彼此密切相關(guān)但與P.merdae 3βHSDH沒有相關(guān)性。推測(cè)5AR和3βHSDH基因簇的攜帶與體外3-oxo-Δ4-LCA的 3-oxoalloLCA和isoalloLCA 產(chǎn)生明顯相關(guān)�；�因組序列還揭示了P. distasonis、Raoultibacter和Eggerthella菌株攜帶3αHSDH基因。表明上述鑒定的擬桿菌目基因簇可以協(xié)同產(chǎn)生isoalloLCA和相關(guān)BAs。
 

構(gòu)建缺乏編碼5AR、3βHSDH或5BR的基因的P. merdae St3突變體，正如預(yù)期的那樣，當(dāng)與3-oxo-Δ4-LCA一起培養(yǎng)時(shí)，P. merdaeΔ5AR無(wú)法產(chǎn)生3-oxoalloLCA或 isoalloLCA，而P. merdaeΔ3βHSDH能夠產(chǎn)生3-oxoalloLCA但不能產(chǎn)生isoalloLCA。同樣地，當(dāng)與3-oxoalloLCA一起培養(yǎng)時(shí)，P. merdaeΔ5AR以類似于野生型菌株的方式產(chǎn)生isoalloLCA，而 P. merdaeΔ3βHSDH 則不能產(chǎn)生。P. merdaeΔ3βHSDH也不能將3-oxoLCA轉(zhuǎn)化為 isoLCA，證實(shí)3βHSDH可以利用反式和順式BAs作為底物。P. merdaeΔ5BR從3-oxo-Δ4-LCA 或 3-oxoalloLCA產(chǎn)生isoalloLCA，但在將3-oxoLCA 轉(zhuǎn)化為3-oxo-Δ4-LCA時(shí)表現(xiàn)出缺陷。這些結(jié)果證實(shí)了5AR、3βHSDH和5BR參與了人類腸道菌群產(chǎn)生3-oxoLCA、isoLCA、3-oxoalloLCA和isoalloLCA。
 

那么這些分離株是否可以在體內(nèi)產(chǎn)生大量的isoalloLCA？把選定12種的擬桿菌屬分離株分別定殖于無(wú)菌 C57BL/6 (B6) 小鼠體內(nèi)，并喂食含3-oxo-Δ4-LCA的飲食。糞便膽汁酸分析結(jié)果顯示只有Odoribacteraceae菌株能誘導(dǎo)isoalloLCA的大量積累。盡管P. merdae St3在體外可以將3-oxo-Δ4-LCA轉(zhuǎn)化為isoalloLCA，但在體內(nèi)僅檢測(cè)到較低水平的isoalloLCA。用P. merdae St3而非P. merdaeΔ5AR定殖的小鼠糞便中表現(xiàn)出顯著的3-oxoalloLCA積累，表明P. merdae 5AR在體內(nèi)活性較弱。B.uniformis、B.thetaiotaomicron 和B.dorei 能夠產(chǎn)生3-oxoalloLCA，但不能有效地將其轉(zhuǎn)化為isoalloLCA。總之，體內(nèi)數(shù)據(jù)表明共生5AR和3βHSDH的活性依賴于環(huán)境，并且腸道環(huán)境（至少在小鼠中）有利于 Odoribacteraceae產(chǎn)生isoalloLCA。
 

圖2. 鑒定參與isoalloLCA和相關(guān)BAs產(chǎn)生的細(xì)菌菌株和基因
 

IsoalloLCA對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病原體的抗菌作用

已知次級(jí)BAs可以調(diào)節(jié)宿主代謝和免疫反應(yīng)（包括調(diào)節(jié)T細(xì)胞）和防止腸道病原體擴(kuò)增。用百歲老人體內(nèi)顯著富集的次級(jí)BAs分別與不同類型革蘭氏陽(yáng)性和陰性病原體共培養(yǎng)，結(jié)果顯示isoalloLCA可顯著抑制所有測(cè)試革蘭氏陽(yáng)性病原體的生長(zhǎng)，在WCA培養(yǎng)基中抑制90%生長(zhǎng)所需的最小抑制濃度(MIC90)值范圍為0.5-3μM，在BHI培養(yǎng)基中為3-6.25μM。相比之下，所有革蘭氏陰性病原體都對(duì)isoalloLCA具有抗性。電子顯微鏡分析顯示isoalloLCA具有殺菌作用，誘導(dǎo)了C. difficile和VRE的形態(tài)學(xué)改變，包括塌陷、腫脹和多重橫壁。這些結(jié)果表明，isoalloLCA對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病原體具有強(qiáng)烈的殺菌/抑菌作用。
 

將來(lái)自艱難梭菌感染（CDI）患者的糞菌移植到無(wú)菌B6小鼠，并喂食含0.1% isoalloLCA的飲食。結(jié)果顯示isoalloLCA給藥顯著減少了C. difficile的脫落。隨后使用Cyp2c70-/- cyp2a12-/-雙敲除(Cyp DKO)小鼠，該小鼠模擬了具有高水平LCA衍生物和缺乏鼠膽酸(MCA)的人類膽汁酸譜。用C. difficile 630感染SPF Cyp DKO小鼠后用Odoribacteraceae St21反復(fù)灌胃。Odoribacteraceae給藥顯著增加糞便isoalloLCA水平并顯著抑制了艱難梭菌脫落，使其低于檢測(cè)下限。相比之下，盡管Odoribacteraceae植入程度相似，但接受相同處理的野生型小鼠未能產(chǎn)生isoalloLCA并抑制艱難梭菌脫落。這些結(jié)果表明 Odoribacteraceae及其衍生物BAs（包括 isoalloLCA），有助于抑制革蘭氏陽(yáng)性病原體在體內(nèi)的擴(kuò)增。
 

圖3. IsoalloLCA對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病原體具有強(qiáng)大的抗菌活性
 

isoalloLCA對(duì)共生腸道菌群的影響

隨后將Bas與培養(yǎng)健康志愿者糞便共培養(yǎng)。與IsoalloLCA孵育后，革蘭氏陽(yáng)性菌(如Faecalibacterium、 Bifidobacterium、Streptococcus)顯著減少，而革蘭氏陰性菌(如Bacteroides、Alistipes)相應(yīng)增加。與百歲老人腸道菌群中Bacteroides和Alistipes的富集和Streptococcus的消失相一致，這表明IsoalloLCA可直接影響腸道菌群結(jié)構(gòu)并保護(hù)腸道免受潛在病原體侵害。
 

腸道菌群結(jié)構(gòu)與膽汁酸譜的關(guān)聯(lián)

對(duì)參與者宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在35個(gè)物種（所有Bacteroidales）中鑒定出5AR和3βHSDH基因簇。這些基因簇可分為三組：V1、V2和V3。V1簇包含5AR以及3βHSDH-I 和3βHSDH-II，存在于Odoribacter的基因組中，V3簇包含5AR和3βHSDH-II，存在于Alistipes的基因組中。而V2簇包含5AR和3βHSDH-1，并由不同的Bacteroidales物種攜帶。同時(shí)V1和V3簇與隊(duì)列中糞便isoalloLCA、3-oxoalloLCA、alloLCA、3-oxoLCA 和 isoLCA 的水平呈正相關(guān)。并且攜帶V1或V3的Odoribacter和Alistipes物種在百歲老人中比其他群體更豐富。而V2簇的豐度與這些BAs的濃度呈負(fù)相關(guān)，這表明5AR與3βHSDH-II(而非3βHSDH-I)一起攜帶是產(chǎn)生isoalloLCA和相關(guān)BAs所必需的。
 

隨后將菌群分為三種類型（稱為群落類型1、2 和 3）。結(jié)果顯示年輕群體的群落結(jié)構(gòu)主要是2型，而百歲老人主要是3型，其次是1型。重要的是，群落類型1和3的個(gè)體，相對(duì)于攜帶V2的個(gè)體，攜帶V1和V3物種的菌群豐度更高。此外，在群落類型1和3的個(gè)體中觀察到更高水平的3-oxoLCA、isoLCA、alloLCA、3-oxoalloLCA和isoalloLCA，而這一趨勢(shì)在CDCA中則相反。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證腸道菌群結(jié)構(gòu)影響腸道BAs，并且群落類型1和3與日本百歲老人有關(guān)，并可能產(chǎn)生有助于isoalloLCA物種擴(kuò)展和發(fā)揮功能的環(huán)境。
 

圖4. 腸道微生物組結(jié)構(gòu)與膽汁酸譜的關(guān)聯(lián)
 

小結(jié)

本研究通過鑒定百歲老人特有的腸道菌群特征，確定了促進(jìn) isoLCA、3-oxoLCA、3-oxoalloLCA 和 isoalloLCA 產(chǎn)生的微生物種類和基因/途徑。同時(shí)還闡述了Isoallo-LCA對(duì)革蘭氏陽(yáng)性（不是革蘭氏陰性）多重耐藥病原體（包括Clostridioides difcile和Enterococcus faecium）強(qiáng)大的抗菌作用。這些發(fā)現(xiàn)揭示，特定的膽汁酸代謝可能參與降低病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)，從而可能有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)。
 

參考文獻(xiàn)

Yuko Sato, et al. Novel bile acid biosynthetic pathways are enriched in the microbiome of centenarians. Nature. 2021.
 

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