單細胞多組學(xué)技術(shù)在流感疫苗作用機制研究的應(yīng)用

文章題目：The single-cell epigenomic and transcriptional landscape of immunity to influenza vaccination.

中文題目：流感疫苗免疫的單細胞表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組圖譜

發(fā)表時間：2021.07

期刊名稱：Cell

影響因子：41.581

實驗平臺：10x Genomics Chromium（scATAC-seq & scRNA-seq）、EpiTOF

DOI：10.1016/j.cell.2021.05.039

//  TIV接種后免疫細胞的表觀基因組重編程
研究者首先使用EpiTOF（epigenetic landscape profiling using cytometry by time-of-flight）技術(shù)分析了21名年齡在18-45歲的健康個體在注射三價滅活季節(jié)性流感疫苗（TIV）前后的表觀基因組變化。所有受試者在第0天接種TIV。為了確定腸道微生物對表觀免疫細胞的影響，10名受試者在-3天到第1天之間額外接受一種口服抗生素方案，包括新霉素、萬古霉素和甲硝唑。對不同時間點（接種前21、0天和接種后1、7、30和180天）PBMC的EpiTOF結(jié)果分析表明，一些受試者的髓樣細胞比例在較晚時間點有降低趨勢，而漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)比例在抗生素治療(第0天、第1天)的反應(yīng)中有瞬時增加的趨勢。利用組蛋白修飾信息繪制表觀免疫細胞的UMAP圖譜并發(fā)現(xiàn)淋巴樣細胞從髓樣細胞中分離出來，而造血祖細胞(CD34+)表現(xiàn)出不同于完全分化免疫細胞的獨特表觀遺傳模式。第30天與第0天樣品點分離，說明TIV誘導(dǎo)表觀組改變。此外，幾種組蛋白標(biāo)記在接種疫苗后的修飾狀態(tài)改變，但與是否使用抗生素?zé)o關(guān)。

// 髓樣細胞中持續(xù)性表觀基因組重編程

免疫后第30天，經(jīng)典單核細胞和髓樣樹突狀細胞(mDCs)表現(xiàn)為H2BK5ac、H3K9ac、H3K27ac、H4K5ac和PADI4被抑制。其中，PADI4與單核細胞發(fā)育和炎癥相關(guān)，與乙�；瘶�(biāo)記具有高度相關(guān)性。四種組蛋白乙�；瘶�(biāo)記和PADI4隨時間降低，在第30天最低，而在第180天基本恢復(fù)到基線水平。血液轉(zhuǎn)錄組分析表明，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CREBBP/CBP和KAT6A在接種后第1、3和7天下調(diào)，而各種組蛋白脫乙酰酶的表達增加。此外，賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的表達增加，這與H3K27ac的拮抗物H3K27me3的表達增加一致。因此，表觀基因組和轉(zhuǎn)錄分析都表明，在TIV免疫后，髓樣細胞處于潛在的低乙�；癄顟B(tài)。

接下來，利用組蛋白修飾標(biāo)記和PADI4表達特征對經(jīng)典單核細胞和mDCs進行亞聚類分析表明，第0天和第1天的細胞與第30天的細胞在2D空間上分開位于兩側(cè)，180天的細胞處于中間狀態(tài)，說明持續(xù)的表觀改變可以TIV免疫6個月后檢測到。

// TIV誘導(dǎo)天然免疫細胞持續(xù)性功能改變

為了確定髓樣細胞表觀遺傳學(xué)變化對功能的影響，研究者在接種前后不同時間點用模擬細菌的人工合成Toll樣受體(TLR)配體或病毒病原體相關(guān)分子刺激PBMCs。刺激24h后，接種后30天的PBMCs中一些細胞因子（TNF-α、IL-12、CXCL5/10和GCSF等）顯著下降。與表觀基因組變化相似，減少的細胞因子在1-7天變化明顯，30天最低，180天恢復(fù)到接近基線水平。所有這些細胞因子都被TLR混合物強烈誘導(dǎo)，且無論是抗生素處理組或?qū)φ战M，其含量都低于第0天水平。將TLR誘導(dǎo)細胞因子與組蛋白修飾水平進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙酰化標(biāo)記，H3K27ac和PADI4，與細胞因子產(chǎn)生呈正相關(guān)。相反，H2BS14ph和幾個抑制甲基化的標(biāo)記，包括H3K27me3和H4K20me3與細胞因子產(chǎn)生呈負相關(guān)。

// TIV誘導(dǎo)髓樣細胞AP-1靶點染色質(zhì)可及性降低

研究者分選富集天然免疫細胞并進行bulk ATAC 分析免疫前后染色質(zhì)可及性變化。與第0天相比，第30天CD14+單核細胞中檢測到10000多個差異可及區(qū)（DAR），mDC 約4500個，而pDC僅有微小差異，這些區(qū)域中大多數(shù)可及性降低，表明基因活性下降。CD14+單核細胞免疫誘導(dǎo)的前200個DAR中，許多免疫相關(guān)基因包括幾種細胞因子和趨化因子及其相關(guān)受體（IL-18、CXCL8等）、病原識別受體和粘附分子可及性下降。這些減少的DAR主要位于非啟動子區(qū)，表明遠端調(diào)控元件如增強子參與其中。接下來，為了確定調(diào)控模式研究者確認(rèn)DARs是否富集了轉(zhuǎn)錄因子（TF）結(jié)合motifs。在單核細胞和mDC的DAR中富集了AP-1家族的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，且攜帶這種motif的DAR在接種后染色質(zhì)可及性下降，特別是非啟動子區(qū)。與組蛋白乙�；�類似，AP-1 轉(zhuǎn)錄因子表達在接種后第7天首次檢測到減少，第28天最為明顯。

為研究表觀和轉(zhuǎn)錄水平的異質(zhì)性，研究者利用單細胞ATAC和單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析從PBMC中富集到的DC細胞，并從62101個細胞中獲得了染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)，生成了固有免疫系統(tǒng)的表觀基因圖譜，識別到了主要的固有免疫細胞類型，包括經(jīng)典與非經(jīng)典單核細胞、mDC和pDC。單細胞轉(zhuǎn)錄組分析得到34368個細胞數(shù)據(jù)。在經(jīng)典單核細胞和mDC中，AP-1的可及性在接種后30天顯著降低，且這種降低在接種后第一天就開始了，說明TIV誘導(dǎo)的表觀基因組重編程在疫苗應(yīng)答的急性階段就已出現(xiàn)。接下來，研究者對經(jīng)典單核細胞進行亞亞群分析并根據(jù)不同的時間模式分為了四個細胞群體。第0天的優(yōu)勢細胞群（cluster6和cluster8）AP-1可及性高，而在cluster5（第30天的優(yōu)勢細胞群）中可及性低，cluster3表現(xiàn)出中等水平的AP-1和CEBP可及性且在整個免疫接種過程中保持穩(wěn)定。異質(zhì)性下游區(qū)富集了與產(chǎn)生致炎相關(guān)因子、TLR信號和AP-1部分成員相關(guān)的區(qū)域，AP-1可及性高的細胞在炎癥基因編碼區(qū)也顯示出高可及性。最后，單細胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)上述富集基因的表達異質(zhì)性小于可及性異質(zhì)性。

Fig.2 單核細胞群體內(nèi)的異質(zhì)性驅(qū)動TIV誘導(dǎo)表觀基因組改變

// AS03佐劑的H5N1流感疫苗誘導(dǎo)髓樣細胞AP-1位點染色質(zhì)可及性降低

研究者將滅活的季節(jié)性流感疫苗研究結(jié)果與前人對卡介苗減毒活疫苗的研究進行比較，并猜測活的卡介苗傳遞了強力的佐劑信號，刺激髓樣細胞持續(xù)的表觀基因組變化，而季節(jié)性流感疫苗由于沒有佐劑，無法得到訓(xùn)練好的免疫力，而是獲得了訓(xùn)練好的耐受性。因此，研究者假設(shè)在滅活的流感疫苗中添加佐劑會引起增強且持久的固有反應(yīng)，并使用AS03佐劑來進行研究。在一組接種了H5N1流感滅活疫苗+AS03或只接種疫苗的健康人中（9v9），利用EpiTOF分析第0、7、21、28和42天的PBMC樣品構(gòu)建組蛋白修飾圖譜。比較第0和第42天的組蛋白修飾情況發(fā)現(xiàn)加入AS03后經(jīng)典單核細胞中H3K27ac、H4K5ac、H3K9ac和PADI4的表達顯著減少，且大多數(shù)在TIV接種后顯著減少的固有細胞因子和趨化因子在加入AS03后也減少。


接下來，從4例PBMC樣品中富集DC細胞（2例H5N1+AS03和2例H5N1，時間點第0、21、42天）并使用單細胞轉(zhuǎn)錄組+單細胞ATAC分析，獲得了58204個細胞的可及性信息和11213個細胞的基因表達信息。結(jié)果表明H5N1+AS03中AP-1的可及性顯著降低。與接種TIV后相似，多個AP-1家族成員包括c-Fos和c-Jun的表達量減少。

Fig.4 H5N1+AS03誘導(dǎo)抗病毒免疫增強的表觀基因組狀態(tài)

主要結(jié)論  

研究者在單細胞水平繪制了人類接種流感疫苗后表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組的免疫圖譜。研究表明，季節(jié)性流感疫苗誘導(dǎo)單核細胞和mDCs中的H3K27ac持續(xù)減少，這與對Toll樣受體刺激的細胞因子受損反應(yīng)有關(guān)。單細胞ATAC測序結(jié)果揭示了一種表觀上獨特的單核細胞亞群，在疫苗接種后，AP-1靶向位點的染色質(zhì)可及性減少。在接種AS03佐劑的H5N1大流行性流感疫苗的反應(yīng)中也觀察到了類似的效果。然而，該疫苗也刺激單核細胞和mDC中干擾素反應(yīng)因子(IRF)位點染色質(zhì)可及性持續(xù)增加。這與抗病毒基因的表達升高以及對無關(guān)的寨卡和登革熱病毒的抵抗力增強有關(guān)。這些結(jié)果表明，疫苗接種刺激了固有免疫系統(tǒng)持續(xù)的表觀基因組重塑，并揭示了AS03作為表觀遺傳佐劑的潛力。

參考文獻  
Wimmers, Florian et al. “The single-cell epigenomic and transcriptional landscape of immunity to influenza vaccination.” Cell vol. 184,15 (2021): 3915-3935.e21.