一種快速的分類外周血PBMC細(xì)胞亞群的方法

默克生命科學(xué)帶你走進(jìn) PBMC免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤等方面，具有重要的應(yīng)用潛力。 PBMC是基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用的細(xì)胞。
 
早在2000年國(guó)際腫瘤生物治療及基因治療年會(huì)中便提出，免疫細(xì)胞療法是現(xiàn)代科技中最有希望徹底清除癌細(xì)胞的腫瘤治療方法。而免疫細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤等方面，具有重要的應(yīng)用潛力。

外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）
免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體防御機(jī)制中起著不可或缺的作用，也是免疫實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)用到的細(xì)胞，從血液中分離得到，常應(yīng)用于臨床診斷、免疫治療和免疫監(jiān)測(cè)研究中。它是由具有單個(gè)圓形細(xì)胞核的血細(xì)胞組成，如單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞群由T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞組成。
分析。
 
如何分離PBMC？并進(jìn)行定量分析？
PBMC是基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用的細(xì)胞。這里介紹一種快速、簡(jiǎn)單、可靠的方法從血液中分離PBMC，并用三種方法測(cè)定PBMC總濃度。
 
 
Ficoll®密度梯度離心法
PBMC分離的常用方法^1–3，也叫做平衡密度梯度離心法：使用超速離心機(jī)對(duì)小分子物質(zhì)溶液，長(zhǎng)時(shí)間離心達(dá)到沉降平衡，在離心管內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。
 
若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會(huì)上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。不同大小的細(xì)胞會(huì)分散在不同的層（圖1）。


 
底層包含F(xiàn)icoll®聚集的紅細(xì)胞。緊靠這一層的是一個(gè)彌漫層，主要包含粒細(xì)胞和未結(jié)合的Ficoll®。由于密度稍低，淋巴細(xì)胞（包括單核PBMC部分）沉積在Ficoll®和最上層血漿/血小板層之間的界面上。將PBMC從界面上取出，使用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌，去除殘留的Ficoll。分離好的細(xì)胞就可以進(jìn)入下一步的分析和培養(yǎng)過(guò)程。
 
Scepter™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)器定量分析
Scepter™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)器基于電阻法的庫(kù)爾特原理，采用手持式設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果更為準(zhǔn)確�；�于庫(kù)爾特原理可以在亞微米和亞皮克分子篩分辨率級(jí)別上區(qū)分細(xì)胞直徑和體積。
 
通過(guò)配備的40μm孔徑的傳感器Scepter™能夠精確的計(jì)數(shù)范圍更廣泛的細(xì)胞類型，包括直徑<6μm的小細(xì)胞，如PBMC和紅細(xì)胞（RBC）⁴，在PBMC的細(xì)胞分群中可以得到非常好的結(jié)果。
 
材料和方法，敲黑板
本方案采用50mL離心管中加入15mL Ficoll®可以較好的處理10 mL脫纖或抗凝劑*處理的外周血（或外周血灰黃層細(xì)胞），更小體積的離心管如15mL也可以使用，但更大體積的Ficoll®有助于更高效的去除紅細(xì)胞，提高PBMC產(chǎn)量。
 
* 建議使用采集后24h的新鮮分離的血液樣本以確保分離細(xì)胞保持較高的活性，
* 抗凝劑包括：肝素、EDTA、檸檬酸、檸檬酸葡萄糖（ACD）和檸檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。
 
PBMC的Ficoll®密度梯度分離步驟
1. 將10毫升血液從采集瓶轉(zhuǎn)移到50毫升離心管中。
2. 添加等量的PBS（1X EmbryoMax®PBS，BSS-1006-A）并通過(guò)反復(fù)吹打混合樣品
注：稀釋血液可降低紅細(xì)胞聚集程度，并釋放RBC結(jié)合的PBMC。如果未稀釋，PBMC可能與紅細(xì)胞共沉淀，降低產(chǎn)量。
3. 向第二個(gè)50毫升試管中加入15毫升Ficoll®。
4. 通過(guò)緩慢移液并以最小的力小心地將稀釋后的血液分層到Ficoll®上。
注：將稀釋后的血液輕輕移液到分離介質(zhì)上，使試管保持一定角度，以添加到Ficoll®中。為了獲得良好的分離，在離心前保持血液和Ficoll®層的分離至關(guān)重要
5. 在不使用制動(dòng)器的情況下，在18–24°C溫度下以400 g x 30 min的速度離心。
注：較高溫度（37°C）會(huì)促進(jìn)紅細(xì)胞聚集并降低產(chǎn)量，而較低溫度（4°C）會(huì)抑制聚集，降低純度。我們建議在18–24°C下進(jìn)行離心。
6. 小心地從離心機(jī)上拆下管子，以免干擾分層。
7. 抽出上部的質(zhì)膜層，小心不要干擾到下部的PBMC界面。
8. 將PBMC層轉(zhuǎn)移到新的50 mL試管中�；厥盏捏w積應(yīng)約為10–12 mL。
注意：盡量收集整個(gè)PMBC層，同時(shí)避免相鄰的Ficoll（R）介質(zhì)和質(zhì)膜層。否則將分別導(dǎo)致粒細(xì)胞或血小板和血漿蛋白的污染。
9. 使用~3體積的PBS在18–24°C下以100 g x 10 min的速度離心清洗PBMC部分。
10. 倒出上清液。將細(xì)胞重懸在5毫升PBS中。將PBS加注至50 mL，然后重復(fù)清洗步驟。
11. 可選：重復(fù)清洗步驟一次
12.  清除上清液并將細(xì)胞顆粒重新懸浮在適當(dāng)體積的PBS（或培養(yǎng)基）中。
注：每毫升血液健康血液中可以獲得0.5至3 x 10⁶個(gè)PBMC細(xì)胞。對(duì)于10毫升血液，在5毫升PBS中重新懸浮顆粒進(jìn)行初始計(jì)數(shù)。在此步驟后添加Rosetteep®人類總淋巴細(xì)胞濃縮雞尾酒（StemCell Technologies目錄號(hào)15223），可大大提高PBMC群的純化。
13.使用Scepter™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)器和Guava easyCyte™ 流式細(xì)胞儀。
14.樣品可能需要進(jìn)一步稀釋，以便使用Scepter™進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，40μm孔徑傳感器的工作濃度范圍=5 x 10⁴–1.5 x 10⁶。
 
三種方法測(cè)定PBMC總濃度

Scepter™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)
Scepter™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)器使用40μm的傳感器，需要吸入75μL細(xì)胞懸浮液吸入傳感器。Scepter™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)通過(guò)傳感器孔徑的每個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞濃度，并在屏幕上顯示基于細(xì)胞大小的直方圖，并計(jì)算出不同淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞群體的個(gè)數(shù)，并通過(guò)體積大小進(jìn)行分群。
 
Guava™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)
每10μL PBMC樣品在190μL PBS中稀釋。然后在Guava easyCyte ™流式細(xì)胞儀上 測(cè)定淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞組分的濃度。
 
細(xì)胞表面染色和亞群測(cè)定
對(duì)于每個(gè)樣品，將100000個(gè)PBMC重新懸浮在100μL PBS+0.1%BSA中。為了區(qū)分PBMC中存在的離散細(xì)胞亞群，使用以下熒光標(biāo)記抗體組合對(duì)樣本進(jìn)行染色：抗CD3-PE（T細(xì)胞）、抗CD19-Alexa-Fluor®488（B細(xì)胞）、抗CD16/CD56-APC（NK細(xì)胞）和抗CD14-PECy7（單核細(xì)胞）（eBioscience）。樣品在室溫下培養(yǎng)20分鐘，用PBS清洗，并在采集前在200μL PBS中再懸浮。在Guava easyCyte™ HT流式細(xì)胞儀上分析樣品（3000個(gè)細(xì)胞/樣品孔）。

結(jié)果
使用Ficoll®進(jìn)行密度梯度離心，可將全血特征性地分離為4層：最上層的血漿層含有血小板、一層很薄的PBMC帶、彌漫性Ficoll®層含有粒細(xì)胞和聚集的紅細(xì)胞顆粒。PBMC可進(jìn)一步細(xì)分為兩個(gè)主要群體：淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。
 
 
用熒光抗體標(biāo)記物對(duì)每個(gè)樣本的小份樣本進(jìn)行染色，以確定PBMC的特征表型。淋巴細(xì)胞亞群可進(jìn)一步細(xì)分為T細(xì)胞（CD3+）、B細(xì)胞（CD19+）和NK細(xì)胞（CD16/56+）。根據(jù)CD14的差異表達(dá)，單核細(xì)胞可以與總淋巴細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。使用流式細(xì)胞儀和權(quán)杖對(duì)樣品進(jìn)行稀釋和分析™ 用于測(cè)定PBMC總濃度的細(xì)胞計(jì)數(shù)器。

Figure 2.
Representative data comparing PBMC samples acquired on the flow cytometer and Scepter™ cell counter. Dot plots show debris
從圖2中的散點(diǎn)圖中，每個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)主要群體：

• 碎片和紅細(xì)胞（黑色）
• 淋巴細(xì)胞亞群（由T細(xì)胞（紅色）
• B細(xì)胞（Aqua）
• NK細(xì)胞（綠色）
• 單核細(xì)胞亞群（藍(lán)色）

雖然這些亞群顯示出一些重疊，但每個(gè)樣本中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞亞群都可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Scepter™細(xì)胞計(jì)數(shù)器基于大小清楚的的分開(kāi)。

Table 1. Lymphocyte and monocyte subset frequencies from nine individual PBMC samples. Aliquots from each sample were analyzed using the Guava easyCyte™ and Scepter™ instruments.
a Values were derived from the diameter histogram plot.
b Values were derived from the forward scatter histogram plot based on total events measured on guava easyCyte™ platform.
c Staining frequencies derived as follows:
%Lymphocytes = (%CD3+ T cells) + (%CD16/56+ NK cells) + (%CD19+ B cells)
%Monocytes = %CD14+ cells
 
 
在9個(gè)樣本中，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的平均細(xì)胞直徑分別為7.23±0.30μm和10.02±0.20μm。所得值與先前報(bào)道的大小范圍一致。⁵此外，PBMC總濃度通過(guò)三種方法測(cè)定：

• Scepter™ 直徑圖
• 流式細(xì)胞儀前向散射
• 抗體染色（圖3）

在所有情況下，不同分析方法之間的結(jié)果一致性很好，數(shù)值變化小于15%。結(jié)果中的微小差異可能是由于定義PBMC分?jǐn)?shù)的門的放置中的主觀性和用戶偏差造成的。

Figure 3. Correlation of PBMC concentrations measured using three different methods of analysis: flow cytometric cell counting, Scepter™ cell counting, and flow cytometry analysis of fluorescently labeled cells.
a Values were derived from the diameter histogram plot
b Values were derived from the forward scatter histogram plot based on total events
c Population counts derived as follows: %Lymphocytes = (%CD3+ T cells) + (%CD16/56+ NK cells) + (%CD19+ B cells); %Monocytes = %CD14+ cells
 
總結(jié)：PBMC是基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用的細(xì)胞。
通過(guò)離心法從血液中分離PBMC最關(guān)鍵第一步。在下游分析中Scepter™可以準(zhǔn)確的對(duì)不同類群的細(xì)胞進(jìn)行有效的分群和計(jì)數(shù)，其結(jié)果和流式直測(cè)以及抗體染色的結(jié)果有很好的一致性。
 
參考文獻(xiàn)

1. Boyum, A. (1968) Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21:77-89.
2. Harris, R. and Ukaijiofo, E. (1970) Tissue typing using a routine one-step lymphocyte separation technique. British J. Haemotol. 18:229- 35.
3. Bain, B. and Pshyk, K. (1972) Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplantation Proceedings. 4:161-63.
4. Smith, J., and Ongena, K. The New Scepter™ 2.0 Cell Counter. Cellutions 2011 Vol. 1: p 19-22).
5. Daniels, V.G., Wheater, P.R., & Burkitt, H.G. (1979). Functional histology: A text and colour atlas. Edinburgh: Churchill Livingstone. ISBN 0-443- 01657-7.

 
General

• Prager, E., et al. (2001) Induction of Hyporesponsiveness and Impaired T Lymphocyte Activation by the CD31 Receptor: Ligand Pathway in T-Cells. J. Immunol. 166: 2364-2371.
• Smith, J., et al. The New Scepter™ 2.0 Cell Counter Enables the Analysis of a Wider Range of Cell Sizes and Types With High Precision. EMD Millipore Cellutions 2011 Vol. 1: p 19-22.

 
 
密度梯度離心還可以用在分離葉綠體、病毒純化、質(zhì)膜、細(xì)胞器等。
如需詳細(xì)操作內(nèi)容，點(diǎn)擊link（https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/primary-cell-culture/ficoll-400）