活體成像觀測生物細胞活動和基因行為等應用

通過分子生物學克隆技術，應用單克隆細胞技術的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預期觀察的細胞的染色體內，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶蛋白的細胞株。
 

 

典型的成像過程是：小鼠經過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動關閉照明燈，在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進行測量和數據處理及保存工作。當選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數，獲得實驗數據。軟件的數據處理和保存功能非常強大，可以加快實驗速度，方便大批量的實驗。

No.2技術應用

通過活體動物體內成像系統(tǒng)，可以觀測到疾病或癌癥的發(fā)展進程以及藥物治療所產生的反應，并可用于病毒學研究、構建轉基因動物模型、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質相互作用研究以及細胞體外檢測等領域。具體應用如下：
 

一.標記細胞

（1）癌癥與抗癌藥物研究
直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估�；铙w生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤及自發(fā)瘤。

（2）免疫學與干細胞研究

將熒光素酶標記的造血干細胞移植入脾及骨髓，可用于實時觀測活體動物體內干細胞造血過程的早期事件及動力學變化。有研究表明，應用帶有生物發(fā)光標記基因的小鼠淋巴細胞，檢測放射及化學藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉移及抗腫瘤免疫治療中復雜的細胞機制。應用可見光活體成像原理標記細胞，建立動物模型，可有效的針對同一組動物進行連續(xù)的觀察，節(jié)約動物樣品數，同時能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉移途徑及抗性蛋白表達的改變。

（3）細胞凋亡

當熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達，產生的融合蛋白無熒光素酶活性，細胞不能發(fā)光，而當細胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase-3在特異識別位點切割去掉抑制蛋白，恢復熒光素酶活性，產生發(fā)光現象，由此可用于觀察活體動物體內的細胞凋亡相關事件。

二. 標記病毒

病毒侵染

以熒光素酶基因標記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結的侵和病毒從血液系統(tǒng)進入神經系統(tǒng)的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標記，用于觀察病毒對機體的侵染過程。

三.標記細菌

(1)細菌侵染研究

可以用標記好的革蘭氏陽性和陰性細菌侵染活體動物，觀測其在動物體內的繁殖部位、數量變化及對外界因素的反應。

(2)抗生素藥物

利用標記好的細菌在動物體內對藥物的反應，醫(yī)藥公司和研究機構可用這種成像技術進行藥物篩選和臨床前動物實驗研究。

四.基因表達和蛋白質相互作用

(1)組織特異性基因表達

熒光素酶（luciferase）是一類生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識別不同的底物，一種細胞可被這兩種熒光素酶標記:renilla熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達的啟動子驅動，作為內參，反應細胞數量的變化;firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅動。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化，在消除細胞數量變化的影響后就可反應特定的啟動子在動物體內的表達活性。

(2)蛋白質相互作用

觀察細胞中或活體動物體內兩種蛋白質的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導入細胞或動物體內表達為融合蛋白。當兩種蛋白有強相互作用時，表達的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時出現生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應用此原理亦可用于研究細胞信號傳導途徑。

(3) 阻斷RNA

通過對比生物發(fā)光的變化，驗證在成年小鼠體內，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達。

五.轉基因動物模型

(1)基因表達

為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。利用其表達產生的熒光素酶與底物作用產生生物發(fā)光，反應目的基因的表達情況，從而實現對目的基因的研究�？捎糜谘芯縿游锇l(fā)育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導特定基因表達，以及其它生物學事件引起的相應基因表達或關閉。

(2)各種疾病模型

研究者根據研究目的，將靶基因、靶細胞、病毒及細菌進行熒光素酶標記，同時轉入動物體內形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在體內的實時表達和對候選藥物的準確反應，還可以用來評估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。